王先坤 ， 李 靜

(婁底職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 湖南 婁底 417000)

犬弓首蛔蟲(Toxocaracanis)是一種重要人獸共患性寄生蟲，可感染多種宿主，包括犬、貓和人類等[1]。含2期幼蟲被犬或人類誤食后在小腸內(nèi)發(fā)育為幼蟲，幼蟲穿透腸壁通過血液循環(huán)進(jìn)入各器官(如肺臟和肝臟)，甚至可進(jìn)入人類神經(jīng)系統(tǒng)，造成癲癇或失明等[2-3]。犬弓首蛔蟲蟲卵廣泛存在于土壤、天然水(特別是死水)和食品表面，且蟲卵可隨病犬糞便排到外界，犬只體表可被含蟲卵的糞污污染。由于部分兒童缺乏良好的衛(wèi)生習(xí)慣，他們可能通過撫摸寵物犬(甚至是流浪犬)或在小區(qū)、公園等地區(qū)玩耍而接觸犬弓首蛔蟲蟲卵，繼而造成相應(yīng)感染[4]。因此，了解地區(qū)犬弓首蛔蟲感染情況及環(huán)境中蟲卵污染情況對防控該病具有重要意義[5-7]。

目前關(guān)于弓首蛔蟲的流行病學(xué)調(diào)查大多集中于寵物犬，對于流浪犬和環(huán)境中犬弓首蛔蟲污染情況的調(diào)查研究相對較少，但這對該病的防控十分重要。近年來，湖南婁底市飼養(yǎng)寵物犬家庭比例逐漸上升，外界流浪犬?dāng)?shù)量也有上升趨勢。婁底市部分季節(jié)氣候潮濕，十分利于犬弓首蛔蟲蟲卵的生存，這在一定程度上提高了人類感染犬弓首蛔蟲病的風(fēng)險。因此，本試驗于2021年3—9月對湖南省婁底市部分地區(qū)寵物犬和流浪犬弓首蛔蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查；對受試地區(qū)附近小區(qū)及公園土壤和池塘水樣品中弓首蛔蟲蟲卵污染情況進(jìn)行檢測；同時對獲得的9個弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，分析其遺傳變異情況，旨在為該病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 犬弓首蛔蟲陽性DNA樣品于本實驗室保存；DNA基因組提取試劑盒為天根通用生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DL 2 000 DNA Marker和2×PCR預(yù)混液等均為北京瀚海拓新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PCR儀和移液器等均為美國吉爾森有限公司產(chǎn)品。

1.2 樣品采集 從婁底市婁星區(qū)、雙峰縣、新化縣和冷水江市收集犬糞便樣品368份，其中寵物犬糞便樣品(247份)采集于寵物醫(yī)院、居民小區(qū)和寵物犬養(yǎng)殖基地等，流浪犬糞便樣品(121份)采集于郊區(qū)公園和流浪犬收容所。環(huán)境樣品(土壤和池塘水樣品共104份)采集于公園和居民小區(qū)。記錄每份樣品采樣時間、地點等信息后將其保存于4 ℃。

對部分檢測為犬弓首蛔蟲病陽性犬只進(jìn)行藥物驅(qū)蟲，將形態(tài)學(xué)鑒定為犬弓首蛔蟲的蟲株標(biāo)記后保存于70%酒精中。本試驗共獲得9個犬弓首蛔蟲分離株，分別來自于婁星區(qū)(LDLX-1、LDLX-2和LDLX-3)、雙峰縣(LDSF-1和LDSF-2)、新化縣(LDXH-1和LDXH-2)和冷水江市(LDLSJ-1和LDLSJ-2)。

1.3 糞便和土壤樣品的犬弓首蛔蟲蟲卵檢測 采用飽和鹽水漂浮法對糞便或土壤樣品中犬弓首蛔蟲蟲卵進(jìn)行檢測：取3.0 g糞便或土壤樣品置于燒杯內(nèi)，并加入30 mL 飽和生理鹽水，用玻璃棒充分?jǐn)噭蚝笠?00目銅篩過濾；于室溫將濾液靜置40 min，用金屬環(huán)(直徑為0.5 cm)小心接觸液面，其后將濾膜抖落在載玻片表面，并多次蘸取不同部位濾液，其后用蓋玻片蓋于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察是否存在犬弓首蛔蟲蟲卵[8]。

1.4 水樣本的犬弓首蛔蟲蟲卵DNA檢測

1.4.1 DNA基因組提取 將水樣品混勻后取40 mL 置于50 mL離心管內(nèi)，3 000 r/min離心15 min，棄去上清后再加入40 mL水樣品，重復(fù)操作3～4次使沉淀重量達(dá)5 g左右，加入適量蒸餾水將沉淀混勻，取200 μL混合液用于DNA基因組提取，其操作步驟嚴(yán)格參考試劑盒說明書進(jìn)行，DNA基因組保存于-20 ℃，待檢。

1.4.2 引物合成及樣品核酸檢測 參照文獻(xiàn)[9]合成檢測犬弓首蛔蟲ATP6 (ATP synthase subunit 6) 基因的特異性引物(PCR產(chǎn)物大小約300 bp)，其序列：ATP6-F1:GTTTGTTGTTTTGGGGGCTA；ATP6-R1:CCAAAGGACGAGAAACCTCA。PCR反應(yīng)體系(25 μL)： 2×PCR預(yù)混液 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板3.0 μL和無菌水8.5 μL，每次PCR反應(yīng)均設(shè)置陽性和陰性對照，其模板分別為已知犬弓首蛔蟲DNA樣品和無菌水。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共35個 循環(huán)；72 ℃ 7 min。反應(yīng)結(jié)束后取適量PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察檢測結(jié)果。

1.5 犬弓首蛔蟲線粒體cox1和nad4基因序列擴(kuò)增

1.5.1 DNA基因組提取 從75%酒精中取出犬弓首蛔蟲蟲株，用蒸餾水沖洗3次，每次5 min。用眼科剪剪取約2 cm蟲體置于2 mL滅菌離心管內(nèi)，加入適量滅菌蒸餾水和鋼珠進(jìn)行勻漿；取適量勻漿液用于DNA基因組提取，其操作步驟參考相應(yīng)的DNA提取試劑盒說明書。

1.5.2 引物合成、PCR擴(kuò)增及測序 參考文獻(xiàn)[10]合成用于擴(kuò)增犬弓首蛔蟲線粒體cox1(JB3和JB4.5)基因序列的引物。擴(kuò)增線粒體nad4所用引物：Nad4-F:ATAATGGAGTTGTTATTATTTTC；Nad4-R:CACCAAAGGAATAGCAAAGC。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×PCR預(yù)混液 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板2.0 μL和無菌水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(cox1基因)或90 s(nad4基因)，共35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。取PCR陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序并拼接。

1.6 序列分析 從GenBank數(shù)據(jù)庫下載具有代表性的犬弓首蛔蟲相關(guān)序列，應(yīng)用DNASTAR軟件分別對蟲株線粒體cox1和nad4核苷酸序列同源性進(jìn)行比對分析；以DnaSP 5.0軟件分析序列核苷酸多樣性、單倍型多樣性和平均核苷酸差異等；以MEGA 7.0軟件中臨接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其模型為Kimura-2-parameter，重復(fù)自舉檢測1 000次。

2 結(jié)果

2.1 婁底市犬弓首蛔蟲感染情況調(diào)查統(tǒng)計 檢測發(fā)現(xiàn)部分樣品中存在犬弓首蛔蟲蟲卵，其為黃褐色、圓形蟲卵，且卵殼較厚，外殼表面凹凸不平，符合犬弓首蛔蟲蟲卵形態(tài)學(xué)特征(圖1)。經(jīng)統(tǒng)計該地區(qū)被調(diào)查樣品犬弓首蛔蟲蟲卵平均檢出率為11.86%(56/472)；其中婁星區(qū)來源樣品陽性率最高，為16.48%，而雙峰縣最低(6.45%)。不同樣品感染情況統(tǒng)計結(jié)果如表1所示，寵物犬來源糞便樣品的犬弓首蛔蟲蟲卵檢出率為11.74%,較流浪犬(17.36%)低；公園和小區(qū)土壤樣品中犬弓首蛔蟲蟲卵檢出率分別為9.09%和3.92%；采用PCR法檢測20份被調(diào)查水樣品中是否存在犬弓首蛔蟲蟲卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有1份公園來源水樣品中含有犬弓首蛔蟲蟲卵核酸(圖略)。

表1 婁底市犬弓首蛔蟲感染情況調(diào)查

2.2 犬弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因序列的PCR擴(kuò)增 9個犬弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因均成功擴(kuò)增，其片段大小約500 bp和1 200 bp，與預(yù)期片段大小相符，無非特異性條帶(圖2)，提示成功擴(kuò)增出犬弓首蛔蟲的cox1和nad4基因序列。

圖2 犬弓首蛔蟲線粒體cox1和nad4基因的PCR擴(kuò)增

2.3 測序及同源性分析 對測序結(jié)果進(jìn)行拼接與比對，發(fā)現(xiàn)9個分離株線粒體cox1和nad4基因序列分別為424 bp和1 197 bp，其A+T含量分別為61.33%～62.28%和67.47%～67.72%。9個蟲株線粒體cox1和nad4核苷酸序列同源性為99.4%～100.0%和98.7%～100.0%；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，本試驗獲得蟲株cox1和nad4核苷酸序列與已知犬弓首蛔蟲對應(yīng)序列同源性分別為99.2%～99.7%和98.6%～99.6%；與獅弓蛔蟲(Toxascarisleonina)、人蛔蟲(Ascarislumbricoides)、豬蛔蟲(Ascarissuum)和貍貓弓蛔蟲(Toxocaratanuki)、犬鉤口線蟲(Ancylostomacaninum)對應(yīng)序列同源性均低于90%。

2.4 遺傳多樣性 本試驗獲得的9個犬弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因序列檢測到單倍型數(shù)量分別為4個和5個；其總單倍型多樣性分別為0.792±0.012和0.843±0.013；核苷酸多樣性分別為0.007±0.002和0.006±0.003；平均核苷酸差異分別為1.958和2.062。

2.5 系統(tǒng)遺傳進(jìn)化分析 將線粒體cox1和nad4基因進(jìn)行串聯(lián)，并用MEGA 7.0軟件中NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果如圖3所示，本試驗獲得的9個犬弓首蛔蟲分離株具有高度同源性，與已知犬弓首蛔蟲分離株(JF780944、MK913433、MT359315和MT942614)在進(jìn)化樹上位于同一分支；與其他蛔蟲屬相比，犬弓首蛔蟲、獅弓蛔蟲(JF780947)和貍貓弓蛔蟲分離株(AB446546)聚為同一群，與豬蛔蟲(MZ008307)和人蛔蟲分離株(MK792813)所屬分支相隔較遠(yuǎn)。上述結(jié)果再次證明本試驗獲得分離株為犬弓首蛔蟲。

圖3 基于線粒體cox1和nad4基因串聯(lián)序列構(gòu)建犬弓首蛔蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

犬弓首蛔蟲的終末宿主是犬科動物，其感染性蟲卵可隨患犬糞便排出，從而污染糞污、附近土壤或水源，人類(特別是兒童)可能因接觸被蟲卵污染的糞污、土壤或水源而誤食感染性蟲卵導(dǎo)致患病。因此，對犬只弓首蛔蟲感染情況及環(huán)境(土壤和水源)蟲卵污染情況進(jìn)行調(diào)查可初步評估該病原對人類健康的威脅。本試驗結(jié)果顯示，婁底市寵物犬弓首蛔蟲蟲卵檢出率較流浪犬低，這可能是由于流浪犬長期缺乏營養(yǎng)導(dǎo)致抵抗力較差，且在外界環(huán)境中更容易接觸犬弓首蛔蟲蟲卵，卻無法得到有效藥物驅(qū)蟲，導(dǎo)致其感染率較高?？傮w而言，婁底市犬弓首蛔蟲病感染情況和湖南衡陽市(13.28%)[11]差異較小，但低于重慶市(77.03%)、揚(yáng)州市(30.65%)和湖南益陽市(54.9%)[12-14]，說明我國不同地區(qū)犬弓首蛔蟲病流行情況存在差異，但仍然較為嚴(yán)重。值得注意的是，本試驗在犬貓經(jīng)常出沒的小區(qū)和公園土壤樣品中也檢測到了犬弓首蛔蟲蟲卵存在，這與盧祖鵬等[15]的調(diào)查結(jié)果一致。此外，部分公園池塘水樣品中也存在犬弓首蛔蟲蟲卵，由于小孩在公園或小區(qū)內(nèi)經(jīng)常接觸土壤或水，可能導(dǎo)致他們接觸到感染性蟲卵，因此對小區(qū)和公園環(huán)境定期進(jìn)行打掃和消毒十分必要。

研究表明，線粒體cox1和nad4基因序列可作為鑒定蛔蟲的分子標(biāo)記[10,16]。本試驗結(jié)果顯示，9個弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因序列種內(nèi)變異率分別為0.0%～0.6%和0.0%～1.3%，可見犬弓首蛔蟲線粒體nad4基因序列較cox1基因序列堿基變異率更高，與龔騰芳等[17]的研究結(jié)果一致[17]?；诰€粒體cox1和nad4基因串聯(lián)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，本試驗獲得蟲株與已知犬弓首蛔蟲分離株屬于同一分支，與其他蟲株所屬分支相隔較遠(yuǎn)，這說明犬弓首蛔蟲cox1和nad4基因種內(nèi)變異遠(yuǎn)低于種間變異，提示線粒體cox1和nad4基因序列可作為犬弓首蛔蟲的分子鑒定標(biāo)志物。進(jìn)一步遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，9個犬弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因核苷酸多樣性均低于0.01，分別為0.007±0.002和0.006±0.003，對于絕大部分寄生蟲來說核苷酸多樣性低于0.01被認(rèn)為變異率較低[16]，故本試驗獲得的犬弓首蛔蟲分離株遺傳變異程度相對較低。

綜上，湖南省婁底市犬(寵物犬和流浪犬)弓首蛔蟲病流行情況相對嚴(yán)重，同時在犬只經(jīng)常出沒的公園和小區(qū)環(huán)境(土壤和水)樣品中也檢測到犬弓首蛔蟲蟲卵。此外，本試驗獲得的9個犬弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因序列變異程度和遺傳多樣性均較低，且這2個基因均可作為鑒定犬公首蛔蟲的分子標(biāo)記。由于該病原的流行對人類健康存在巨大威脅，故相關(guān)人員應(yīng)引起對該病的重視。