亓 菲 ， 樊曉旭 ， 劉蒙達 ， 孫淑芳 ， 范偉興 , 溫建新

(1.青島農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 山東 青島 266109 ; 2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心 ， 山東 青島 266032)

結核分枝桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)的成員包括結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis，bTB)、非洲分枝桿菌(Mycobacteriumafricanum)、田鼠分枝桿菌(Mycobacteriummicroti)和山羊分枝桿菌(Mycobacteriumcaprae)等。其中結核分枝桿菌和牛分枝桿菌分別是人結核病、牛結核病的主要病原菌。至今，結核病仍是威脅人類社會及畜牧業(yè)發(fā)展的重要人獸共患傳染病。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，2019年全球有1 000萬(890萬～1 100萬)人感染了結核病，近年來這一數字相對穩(wěn)定。在所有結核病病例中，8.6%是艾滋病病毒感染者。從地理分布上看，2019年結核病病例大多分布在東南亞(44%)、非洲(25%)和西太平洋(18%)。從全球分布看，印度(26.0%)、印度尼西亞(8.5%)和中國(8.4%)所占比例較高[1]。近年來，由于抗生素過度和不當使用，出現(xiàn)了多種耐藥結核菌，包括對一線結核藥物異煙肼(Isoniazid，INH)和利福平(Rifampicin，RIF)具有耐藥性的耐多藥結核菌株(MDR)及在MDR基礎上對氟喹諾酮類藥物以及二線抗結核注射劑(卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那)中的至少1種耐藥的廣泛耐藥結核菌株(XDR)?？股啬退幮?AMR)已成為全球結核病防控的難點。據WHO統(tǒng)計，2019年3.3%的新結核病例和17.7%的先前治療的病例是耐多藥結核病。2019年，新發(fā)利福平耐藥結核病病例約50萬例(其中78%為耐多藥結核病)。全球結核病負擔最大的3個國家分別是印度(27%)、中國(14%)和俄羅斯聯(lián)邦(8%)。聯(lián)合國報告預計，如果對抗生素耐藥不加控制，到2050年每年可能導致多達1 000萬人因患結核病而死亡。鑒于此，本文綜述了常見抗結核藥物及其耐藥研究進展，總結了結核耐藥監(jiān)測與檢測方法，為結核病耐藥性研究提供參考。

1 MTBC的耐藥機制及常見抗結核藥物的耐藥情況

1.1 MTBC的耐藥機制 耐藥性是結核病治療的主要障礙，對全球公共衛(wèi)生和治療提出了挑戰(zhàn)。盡管抗結核藥物有療效，但仍出現(xiàn)了MTBC的耐藥分離株。多種機制促進了 MTBC耐藥性的進化，例如代償性進化、上位性、克隆干擾、細胞包膜不滲透性、外排泵、藥物降解和修飾、靶標擬態(tài)和表型藥物耐受性[2]。結核病治療失敗可能是由于內在(天然存在的高水平抗生素耐藥性)和外在(新獲得的突變)的抗生素抗性[3]。

1.2 常見抗結核藥物的耐藥情況

1.2.1 利福平(RIF) MTBC的rpoB基因編碼 RNA聚合酶β-亞單位，含有RIF耐藥決定區(qū)域(RIF ampicin resistance-determining region，RRDR)，即密碼子第507～533位的區(qū)域(長度為 81 bp)，此區(qū)域發(fā)生突變或缺失時，RIF與RNA聚合酶β-亞基的親和力降低，進而表現(xiàn)出對RIF的耐藥性。目前發(fā)現(xiàn)超過95%的RIF耐藥與rpoB基因中81個堿基對片段的突變有關，其中密碼子第526位或第531位的突變占65%～86%，會產生對RIF的高度耐藥，而第511、516、518位和第522位密碼子的突變與MTBC對利福平低水平的耐藥相關[4]。據報道，80%的利福平耐藥株同時對異煙肼耐藥，因此利福平耐藥被看作是MDR的一個主要標志[5]。

1.2.2 異煙肼(INH)KatG基因：INH發(fā)揮抗菌作用需借助KatG基因編碼的過氧化氫酶-過氧化物酶，當KatG基因發(fā)生突變或缺失，導致過氧化氫酶-過氧化物酶的合成受阻，活化INH的能力減弱，進而產生耐藥。在全球范圍內，觀察到的所有表型異煙肼耐藥性中有64%與KatG基因315位點突變有關。

inhA基因：當inhA基因發(fā)生突變、缺失或插入時，會降低INH活化產物與inhA活性部位的親和力，導致耐藥；inhA突變也會發(fā)生在啟動子位置，造成inhA產物的過度表達，超出INH的抑制范圍而產生耐藥。inhA最常見的突變是第94位密碼子絲氨酸→丙氨酸，啟動子區(qū)域-15(C→T)的突變也較為普遍，占耐藥突變類型的10%～34%[6-7]，該突變引起對INH低水平耐藥。啟動子第8位(T→G)、第16位(A→G)和第24位(G→T)密碼子的突變也會導致對INH產生耐藥。

1.2.3 乙胺丁醇(Ethambutol，EMB) MTBCembB基因第306位密碼子的修飾導致糖基轉移酶的結構隨之改變，被認為是導致MTBC臨床分離株對EMB耐藥的主要機制[8]。通過檢測密碼子第296～497位的embB區(qū)，以及在第-8～-21位包括embC～embA基因間隔區(qū)，可以提高基于embB密碼子第306位檢測EMB耐藥性的診斷方法的敏感性[9]。

1.2.4 吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA) 吡嗪酰胺酶的功能失調是由于其編碼基因(pncA)突變，以及啟動子區(qū)域損害蛋白的表達[10]，導致PZA無法轉化為吡嗪酸，致使藥物無法發(fā)揮作用。pncA基因中，D12A、D49N、T47A、L85P和T135P突變與PZA抗性顯著相關[11]。

1.2.5 鏈霉素(Streptomycin，STR) 據WHO報告顯示，在全球范圍內，結核病新病例和以前治療過的病例中，鏈霉素耐藥率分別為10.9%(參考范圍：8.0%～13.7%)和20.1%(參考范圍：12.2%～28.0%)。Spies等[12]進行的一項研究表明，27%的鏈霉素耐藥菌株出現(xiàn)gidB突變，并且與低水平鏈霉素耐藥相關，這些菌株的rpsL或rrs基因沒有突變[12]。rpsL基因突變率高于rrs基因，rpsL基因突變占STR耐藥菌株的13.2%～80.0%，rrs突變占0%～28%。rpsL突變位點最常見的為第43位(AAG→AGG)和第88位(AAG→AGG)。

1.2.6 氟喹諾酮(Fluoroquinolone，F(xiàn)Q) 氟喹諾酮類藥物被證明是最有效的二線抗分枝桿菌藥物，對氟喹諾酮類藥物抗性的遺傳機制是DNA旋轉酶變化的結果，特別是gyrA(第74～113位密碼子)和gyrB(第500～538位密碼子)的喹諾酮耐藥性決定區(qū)(Quinolone resistance determining region，QRDR)突變[13]。一項系統(tǒng)性研究表明，大約60%～90%的具有FQ抗性的MTB臨床分離株在gyrA的QRDR中發(fā)生突變，我國有85%的突變發(fā)生在第88～94位密碼子中。gyrB突變也與FQ抗性相關，但敏感性和特異性較低，它們通常與典型的gyrA突變共同發(fā)生，并且最常見于第500位和第538位密碼子。gyrA和gyrB中的雙重突變可產生較高水平的抗性。

1.2.7 阿米卡星(Amikacin，AMK)、卡那霉素(Kanamycin，KAN)和卷曲霉素(Capreomycin，CAP)rrs、tlyA、eis啟動子和gidB基因突變與MTBC對AMK、KAN和CAP的抗性相關。rrs基因編碼16S rRNA，rrs基因最常報道的突變包括A1401G、C1402T和G1484T。在這3種耐藥菌株的gidB基因中，G102缺失的出現(xiàn)頻率很高(17%～20%)，也可見T230C、C286T、T104G和A254G的突變[14]。

1.2.8 D-環(huán)絲氨酸(D-cycloserine) D-環(huán)絲氨酸耐藥相關基因包括alr、ddlA、ald和cycA。D-環(huán)絲氨酸通過競爭性抑制丙氨酸代謝途徑中的2種酶[丙氨酸消旋酶(由rv3423c編碼，alr)和D-丙氨酸連接酶(由rv2981c編碼，ddlA)]發(fā)揮抑菌作用。有研究證明，L-丙氨酸脫氫酶ald(Rv2780)功能缺失在體外對D-環(huán)絲氨酸產生耐藥性[15]。

1.2.9 乙硫酰胺(Acetamide) 由于乙硫酰胺作用于與異煙肼(inhA基因編碼的inhA蛋白)相同的靶蛋白。研究表明，乙硫酰胺耐藥與低水平異煙肼耐藥顯著相關，ethA突變占乙硫酰胺耐藥菌株的47%，inhA及其啟動子區(qū)域的突變占55%[16]。

1.2.10 利奈唑胺(Linezolid，LZD) 一些臨床研究表明，LZD治療耐多藥結核病有效，但耐多藥結核分枝桿菌的耐藥率在1.9%～10.8%。rrl基因G2061T或G2576T突變可能導致結核分枝桿菌體外分離株對LZD產生抗性。最近的一項研究表明，在7個耐LZD的結核分枝桿菌突變體中的6個中發(fā)現(xiàn)了編碼L3核糖體蛋白的rplC基因存在T460C突變[17]。

1.2.11 氯法齊明(Clofazimine，CFZ) 抗麻風病藥物氯法齊明近幾年被重新用于治療耐多藥結核病，WHO已將其地位從第5組抗結核藥物提升為耐多藥結核病患者的核心二線藥物。目前發(fā)現(xiàn)的CFZ耐藥基因有rv0678、rv2535c和rv1979c，其中rv0678突變是氯法齊明耐藥的主要機制[18]。

2 耐藥監(jiān)測與檢測方法

2.1 藥物臨界濃度法 將標準培養(yǎng)物接種在無藥物培養(yǎng)基和含有待測抗結核藥物分級濃度的培養(yǎng)基上，測試每種藥物在不同濃度下，抑制細菌生長的效果。發(fā)揮抑制效應的最低濃度即最小抑菌濃度(MIC)。這是一種在固體介質上的間接方法，周轉時間(TAT)約4周，可以作為直接或間接的方法使用。但此方法耗時較長，且需精確配置試驗所需的菌懸液濃度以減少誤差。

2.2 自動化液體培養(yǎng)系統(tǒng) BACTEC MGIT 960系統(tǒng)目前被WHO推薦為二線DST的黃金標準。該系統(tǒng)是一個自動化的、連續(xù)的監(jiān)測系統(tǒng)，它使用富含14C標記棕櫚酸作為唯一碳源的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基(12B小瓶)。用BACTEC MGIT-960系統(tǒng)獲得耐藥菌株藥敏試驗結果的平均時間為6 d，范圍為5～14 d，與固體培養(yǎng)基的4周時間相比大大縮短。

2.3 硝酸還原酶法(NRA) NRA基于MTBC將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的能力，可通過向培養(yǎng)基中添加化學試劑(格里斯試劑)來檢測。誘導顏色變化后，可在孵育的7～14 d內讀取結果。直接和間接NRA對INH、RIF、STR和EMB耐藥性檢測的靈敏度和特異性與常規(guī)方法相當[19]。

2.4 基于PCR的檢測方法 GeneXpert MTB/RIF通過分子信標和半巢式實時PCR技術，能在2 h內完成結核病的診斷和RIF耐藥性檢測。GenoType MTBDRplus分析是一種定性的體外試驗，可以檢測痰中的MTB DNA以及與rpoB基因、katG基因和inhA調節(jié)區(qū)基因相關的突變。

2.5 基因序列測定 DNA測序是分子生物學方法金標準，可以確定DNA的部分或整個核苷酸序列信息。焦磷酸測序主要用于短讀測序和單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析，該方法能夠縮短TAT時間，從DNA提取到獲得結果僅需6 h。但是，焦磷酸測序測出的DNA序列長度較短，僅能夠測得20～50個核苷酸。全基因組測序(WGS)可識別細菌所有基因的遺傳多態(tài)信息[20]，包括SNP和小的插入和缺失[21]。

3 牛分枝桿菌耐藥情況

3.1 牛結核病的藥物治療 我國曾在奶牛結核病藥物治療上做了一些試驗研究，獲得過一定的結果，所應用的治療藥物均以抗結核桿菌藥物為主，如異煙肼、對氨基水楊酸鈉和鏈毒素，治療后患牛在臨床上有所好轉，產奶量增高。對結核菌素陽性反應的犢牛早期應用異煙肼或異煙腙連續(xù)進行3～6個月的治療，也獲得了良好的治療效果。意大利也曾有應用異胭肼治療牛結核在臨床上得到改善的報道?？股刂委熍＝Y核雖然顯示出一定的療效，但綜合各種實際因素來看，結核病牛治療價值不大，所以近年來一般做淘汰處理。

3.2 牛分枝桿菌耐藥情況 一項對從牛淋巴結中分離的bTB的耐藥性進行的研究發(fā)現(xiàn)，RIF耐藥基因突變位點集中于rpoB基因的第513(CAA→AAA)、516(D→V)、531(TCG→TTG)、521(CTG→CCG/CTT)位和第526(CAC→GAC)位密碼子[22]。也有研究表明，bTB的INH耐藥基因突變常發(fā)生于katG基因的第315(AGC→ACC)、463(CTG→CGG)位和第506(GAG→AAG)位密碼子；inhA啟動子的第-15(C→T)、-16位(A→G)和第-8位(T→C/A)[23]。一項對bTB鏈霉素耐藥性進行的研究中發(fā)現(xiàn)，在rpsL基因中存在密碼子第43位(AAG→AGG)的非同義突變，在rrs基因和gidB基因中未見相關耐藥基因的突變[24]。pncA基因的第57位氨基酸發(fā)生突變使bTB對吡嗪酰胺具有天然耐藥性。

3.3 用藥物防治牛結核病的弊端 用抗生素治療結核病牛往往不能獲得理想的療效，即使人結核病接受多種藥物治療幾個月也是如此；牛分枝桿菌對用于治療人類結核病的一線藥物之一(吡嗪酰胺)具有天然耐藥性，當前人結核菌株多重耐藥問題已經成為嚴重的公共衛(wèi)生問題，為消除耐藥牛分枝桿菌菌株感染人類的風險，必須確保避免對動物結核病實施藥物防治而人為選擇出耐藥的牛分枝桿菌菌株；如果對結核感染牛實施治療，必須考慮治療期間的傳染性控制問題，并嚴格遵守奶和肉休藥時間的規(guī)定。

4 耐藥性解決策略

4.1 貫徹“同一健康”理念，擴大監(jiān)測覆蓋范圍 盡管牛一般不接受結核病治療，但從牛體分離到了耐藥結核菌。在環(huán)境中，如廢水系統(tǒng)和存在廢水流失的環(huán)境，如河流、溪流和海洋，可能是耐藥細菌的滋生地。人類接觸動物、外界環(huán)境，都可能感染耐藥結核菌。因此，要秉承“人—動物—環(huán)境”這一“同一健康”理念，擴大對耐藥結核的監(jiān)測覆蓋范圍。

4.2 進一步研究結核耐藥機制 例如乙硫酰胺ethA基因的突變具有多樣性，目前尚未發(fā)現(xiàn)其突變規(guī)律。結核分枝桿菌利奈唑胺耐藥相關突變的遺傳分析信息有限，需要進一步研究耐藥機制，為未來檢測和藥物的改進、開發(fā)提供參考。

4.3 改進現(xiàn)有檢測方法，開發(fā)新的快速診斷方法 全基因組測序(WGS)仍然是結核病菌株分析的一種相對新穎的方法。到目前為止，還沒有包含所有分析階段的商業(yè)試劑盒，而且實驗室技術和數據處理方面尚未完全標準化，因此需要進一步優(yōu)化。應開發(fā)更敏感、特異的快速診斷方法，及時發(fā)現(xiàn)菌株的耐藥情況，并指導耐藥性結核的治療，防止耐藥進一步發(fā)展。

4.4 開發(fā)作用于已知靶點、新靶點的藥物 隨著藥物的使用，對于某些已知靶點的抑制效果下降。例如，異煙肼是一種需要通過MTBCKatG進行生物激活的前藥，近70%的INH耐藥菌株顯示KatG中的突變，這可能導致無法激活INH前藥。為了克服KatG的突變，需要合成不需要KatG激活的INH類似物，針對已知靶點開發(fā)新藥。此外，需要針對新的潛在靶點開發(fā)藥物。

4.5 探索新的藥物組合 一線藥物利福平與異煙肼合用可以減少耐藥性的產生。對嚴重感染，可以合用吡嗪酰胺、利福平和異煙肼。一項名為PaMZ的研究是第1個接受臨床試驗的新型多藥結核病治療方法，它包括PA-824、PZA和莫西沙星的聯(lián)合方案[25]。PaMZ有可能治愈藥物敏感結核病和某些耐多藥結核病，同時將治療時間從2年縮短到4個月。在未來，應根據地區(qū)的耐藥性監(jiān)測情況，合理用藥，并探索新的藥物組合，降低耐藥結核出現(xiàn)的可能性。

5 展望

抗結核藥物的使用不當讓多重耐藥菌和廣泛耐藥菌不斷出現(xiàn)，更加刺激了對結核分枝桿菌耐藥基因分子機制的研究。目前，基因芯片技術的興起，耐藥基因位點的測定在臨床工作中已經得到廣泛的應用，但仍然缺乏一種100%敏感和特異的方法來診斷耐多藥結核病。當前形勢下，新的藥物和新的藥物組合的開發(fā)也變得迫在眉睫。因此，需要更多的關注和研究，在不同的環(huán)境中開發(fā)有效和廉價的方法來克服這一世界性問題。