戴東文 ，龐凱悅 ，王迅 ，楊英魁 ，柴沙駝 *，王書祥 *

（1. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 青海省高原放牧家畜營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；3. 青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，青海 西寧 810016）

牦牛主要棲息在青藏高原及周圍地區(qū)，是青藏高原的優(yōu)勢(shì)畜種，也是當(dāng)?shù)啬撩裰匾纳a(chǎn)生活資料［1］。由于青藏高原獨(dú)特的地理環(huán)境，一年只有“冷季”與“暖季”之分，與冷季相比，暖季牧草產(chǎn)量與營養(yǎng)成分雖然有所提高，但是仍不能滿足牦牛高效生產(chǎn)的需要，傳統(tǒng)放牧條件下生長效率較低［2-3］。瘤胃是反芻動(dòng)物消化日糧的重要場(chǎng)所，其含有豐富的細(xì)菌、真菌、原蟲等微生物。瘤胃微生物在蛋白質(zhì)、碳水化合物和淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)消化中發(fā)揮重要作用，通過厭氧發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白，為宿主提供能量和蛋白質(zhì)［4-5］。影響反芻動(dòng)物發(fā)酵的因素有很多，其中飼糧精料水平是其中一個(gè)重要的因素。楊碩等［6］研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)飼精料降低了大青山絨山羊瘤胃內(nèi)與纖維分解相關(guān)細(xì)菌的豐度，而提高了產(chǎn)甲烷菌豐度。有研究表明，隨著精料水平的提高，奶牛瘤胃中纖維降解菌的生長受到抑制，而產(chǎn)酸菌的豐度增加［7］。因此，適宜的精料補(bǔ)飼水平能夠優(yōu)化反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系，提高飼料利用率及動(dòng)物的生產(chǎn)性能。本課題前期研究了精料水平對(duì)暖季放牧牦牛生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，暖季放牧牦牛飼喂較高精料水平時(shí)可獲得較好的生長性能和養(yǎng)殖收益［8］，這可能與不同精料補(bǔ)飼水平影響了牦牛瘤胃菌群組成與結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此，本試驗(yàn)通過16s rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)來探討不同精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃菌群的影響，以期為青藏高原暖季放牧牦牛精準(zhǔn)補(bǔ)飼提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年7-9月在青海省貴南縣老扎西牧場(chǎng)進(jìn)行，該草場(chǎng)屬于高寒草甸草地，優(yōu)勢(shì)種有小嵩草（Kobresia humilis）、高山嵩草（Kobresia pygmaea）、矮嵩草（Kobresia humilis）、線葉嵩草（Kobresia capillifolia）等。選取健康、體況良好和體重相近（123.96±7.43）kg 的公牦牛48 頭，隨機(jī)分為4 組（每組12 頭）：對(duì)照組（放牧）、補(bǔ)飼組每頭分別補(bǔ)飼0.5（Ⅰ）、1.5（Ⅱ）和2.5 kg·d-1（Ⅲ）精料。試驗(yàn)期為70 d，其中預(yù)試期10 d，正式期60 d。

1.2 飼養(yǎng)管理與日糧成分

所有試驗(yàn)牦牛在同一草場(chǎng)放牧，設(shè)置4個(gè)面積大小一樣的圍欄小區(qū)，8：00 出牧，18：00 收牧，3個(gè)補(bǔ)飼組在出牧前和收牧后分兩次進(jìn)行補(bǔ)飼，所有試驗(yàn)牦牛自由飲水。補(bǔ)飼精料參照肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T815-2004），結(jié)合放牧牦牛采食量配制［9］。牧草營養(yǎng)水平、精料組成以及精料營養(yǎng)水平見表1。

表1 牧草營養(yǎng)水平、精料組成以及精料營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Nutrient level of the pasture，ingredient and nutrient level of the concentrate supplement（DM basis）（%）

1.3 瘤胃液的采集

正式試驗(yàn)第60 天，晨飼前采用胃管式采樣器（GCYQ-1-A，武漢市科立博器材有限公司）采集瘤胃液150 mL，4 層紗布過濾后立即測(cè)定pH 值，剩余瘤胃液樣品分裝至15 mL 離心管中，立即儲(chǔ)存到液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.4.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定 pH：使用臺(tái)式酸度計(jì)（HANNA HI221，北京菁美瑞科技有限公司）測(cè)定瘤胃液pH，測(cè)定前對(duì)該酸度計(jì)使用相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行校正；參照馮宗慈等［10］改進(jìn)的比色法測(cè)定瘤胃液氨態(tài)氮（NH3-N）濃度，儀器為紫外可見分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用儀器有限公司），預(yù)熱30 min，在波長625 nm 處測(cè)定溶液吸光度（optical density，OD）值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品的NH3-N 濃度；采用考馬斯亮藍(lán)法［11］在595 nm 波長處比色測(cè)定微生物蛋白（microprotein，MCP）濃度（A045-2，試劑盒購于南京建成生物工程研究所）；使用日本島津GC-2014 型氣相色譜儀測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）濃度［12-13］。

其中VFA 濃度測(cè)定條件為：氫火焰離子檢測(cè)器（FID，日本島津有限公司），色譜柱為毛細(xì)管柱（FFAP，30.00 m×0.32 mm×0.50 μm）；升溫條件為，初始 60 ℃，以 10 ℃·min-1升溫至 120 ℃，保留 2 min，以 15 ℃·min-1升溫至 180 ℃，保留 5 min，汽化室溫度 250 ℃；FID 溫度 250 ℃；進(jìn)樣量 1 μL，載氣為高純氮?dú)猓?9.99%），壓力0.7 MPa；氫氣壓力0.4 MPa，空氣壓力0.4 MPa，毛細(xì)管柱壓力0.6～0.8 MPa，分流比 40∶1。

1.4.2 瘤胃微生物DNA 提取、測(cè)序 每組隨機(jī)選擇4 頭牛的瘤胃液樣品置于冰上解凍并充分混合，參考Denman 等［14］的CTAB 方法提取瘤胃樣品基因組DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的純度和濃度，取適量的樣本于離心管中，用無菌水稀釋樣本至1 ng·μL-1。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA 基因的V3～V4 區(qū)，合成帶有Barcode 的特異引物。通用引物序列 515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′。PCR 采用 25 μL 擴(kuò)增體系；DNA 模板 5 ng，5 μmol·L-1的上、下游引物各 1 μL，2 ng·μL-1的牛血清白蛋白（BSA）3 μL，2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)加至 25 μL；PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，共 30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用QIAquickPCR 純化試劑盒（Qiagen，德國）純化回收，符合要求的DNA 樣品送至北京奧維森基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Mixed PE 300。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析 測(cè)序平臺(tái)得到的原始數(shù)據(jù)使用Trimmomatic（Version 0.36）軟件去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，然后通過vsearch 軟件和物種數(shù)據(jù)庫去除嵌合體，得到有效序列。篩選相似性在97%以上的序列生成OTUs，然后對(duì)OTU 聚類、物種分類學(xué)、多樣性指數(shù)、群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016 初步整理后，采用SPSS 24.0 進(jìn)行單因素ANOVA 模型方差分析，并用Duncan 氏法進(jìn)行組間的多重比較，通過正交多項(xiàng)式比較精料補(bǔ)飼水平的線性和二次效應(yīng)，P＜0.05 表示差異顯著，結(jié)果均以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤（standard error of mean，SEM）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表2 可知，隨著精料補(bǔ)飼的提高，牦牛瘤胃液pH、乙酸濃度和乙酸/丙酸值呈線性和二次降低（P＜0.05）；補(bǔ)飼Ⅱ和Ⅲ組的微生物蛋白濃度顯著高于其他兩組（P＜0.05）；瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸（total volatile fatty acids，TVFA）、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸濃度隨精料補(bǔ)飼水平的提高呈線性和二次提高（P＜0.05）。結(jié)果表明，適當(dāng)提高精料補(bǔ)飼水平，促進(jìn)了暖季牦牛瘤胃發(fā)酵。

表2 精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 2 Effect of different concentrate supplement levels on rumen fermentation parameters of grazing yaks in the warm season

2.2 精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃細(xì)菌豐富度與多樣性的影響

由圖 1 可知，4 組共產(chǎn)生 3138個(gè) OTU，其中對(duì)照組、補(bǔ)飼Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組分別產(chǎn)生 2482、2285、2252 和 2014個(gè)OTU；相 對(duì) 應(yīng) 的 獨(dú) 有 OTU 數(shù) 目 分 別 為 183、169、90、106個(gè)，共 有 OTU 數(shù)目為 1337個(gè) ，占 總 OTU 數(shù) 目 的42.61%。由圖2 可知，隨著測(cè)序深度的增加，4 組瘤胃細(xì)菌稀釋曲線趨于平緩，說明測(cè)序程度已基本覆蓋到樣品中所有的細(xì)菌物種。通過α 多樣性分析（表3）可知，隨著精料補(bǔ)飼水平的提高，牦牛瘤胃液細(xì)菌的物種數(shù)、Chao1指數(shù)和香農(nóng)（Shannon）指數(shù)呈線性和二次降低（P＜0.05），細(xì)菌覆蓋率在各組間無顯著差異（P＞0.05）。通過PCoA（圖3）分析可知，不同精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響差異明顯，其中補(bǔ)飼Ⅱ和Ⅲ組細(xì)菌結(jié)構(gòu)較為接近。以上結(jié)果表明，精料補(bǔ)飼水平能顯著影響暖季放牧牦牛瘤胃細(xì)菌的多樣性，精料補(bǔ)飼水平越高，瘤胃細(xì)菌豐富度與多樣性越低。

圖3 PCoA 分析Fig.3 Analysis by principal co-ordinate analysis

表3 精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃細(xì)菌Alpha 多樣性的影響Table 3 Effect of different concentrate supplement levels on alpha diversity of rumen bacteria of grazing yaks in the warm season

圖1 OTU 韋恩圖Fig.1 OTU venn diagram

圖2 瘤胃細(xì)菌稀釋曲線Fig.2 Sparse curve of ruminal bacteria

2.3 精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃細(xì)菌組成的影響

由表4 可知，在門水平上，隨著精料補(bǔ)飼水平的提高，瘤胃擬桿菌門（Bacteroidetes）相對(duì)豐度呈線性和二次提高（P＜0.05）；而厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度隨精料補(bǔ)飼水平提高呈線性和二次降低（P＜0.05）；放線菌門（Actinobacteria）相對(duì)豐度隨精料補(bǔ)飼水平的提高呈線性提高（P＜0.05）；其他菌門組間無顯著差異（P＞0.05）。由表5 可知，在屬水平上，隨著精料補(bǔ)飼水平的提高，瘤胃普雷沃菌屬_1（Prevotella_1）、克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）及普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）相對(duì)豐度呈線性和二次提高（P＜0. 05）；而解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）和瘤胃球菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）相對(duì)豐度隨著精料補(bǔ)飼水平的提高呈線性和二次降低（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃細(xì)菌結(jié)構(gòu)有一定的影響。

表4 精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃細(xì)菌組成門水平的影響Table 4 Effect of different concentrate supplement phylum levels on the microbe composition of grazing yaks in the warm season（%）

表5 精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃細(xì)菌組成屬水平的影響Table 5 Effect of different concentrate supplement genus levels on the microbe composition of grazing yaks in the warm season（%）

3 討論

3.1 精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃揮發(fā)性脂肪酸（VFA）是反芻動(dòng)物發(fā)酵日糧的產(chǎn)物，是機(jī)體的主要功能物質(zhì)，也是反映瘤胃發(fā)酵功能的重要指標(biāo)，其包括乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸。陳志龍等［15］研究發(fā)現(xiàn)，提高飼糧精粗比能顯著降低綿羊瘤胃液pH 值。本研究結(jié)果表明，提高精料補(bǔ)飼水平，瘤胃液pH 值呈下降趨勢(shì)，且補(bǔ)飼Ⅱ和Ⅲ組瘤胃液pH 值顯著低于對(duì)照組，結(jié)果與其相一致。這可能是隨著精料補(bǔ)飼水平的提高，牦牛攝入的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的含量也上升，發(fā)酵后產(chǎn)生大量的VFA 和乳酸等物質(zhì)，導(dǎo)致瘤胃液pH 值下降。瘤胃氨態(tài)氮（NH3-N）是瘤胃微生物利用飼料中的蛋白質(zhì)合成的，也是瘤胃微生物蛋白（MCP）合成的前體，其濃度反映了瘤胃微生物分解含氮物質(zhì)產(chǎn)生NH3-N 的速度及對(duì)其的攝取利用情況。本試驗(yàn)中，NH3-N 濃度隨著精料補(bǔ)飼水平的提高而下降，而瘤胃液MCP 濃度上升，這與張瑩瑩等［16］和丁靜美等［17］的研究結(jié)果一致。可能原因是瘤胃微生物快速發(fā)酵非結(jié)構(gòu)性碳水化合物從中獲得充足的能量，促進(jìn)了微生物利用NH3-N 合成MCP 的速度，從而降低了瘤胃NH3-N 濃度。李嵐捷等［18］研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼糧NFC/NDF 水平的提高，犢牛瘤胃丙酸、丁酸、戊酸和TVFA 濃度顯著增加，而乙酸濃度和乙酸/丙酸值顯著降低。占今舜等［19］研究也發(fā)現(xiàn)，提高飼糧精粗比，提高了湖羊瘤胃丙酸、丁酸、戊酸和TVFA 濃度。本研究中，隨著精料補(bǔ)飼水平的提高，牦牛瘤胃丙酸、丁酸和TVFA 濃度顯著增加，而乙酸濃度和乙酸/丙酸顯著降低，與以上研究結(jié)果相一致。丙酸是反芻動(dòng)物體內(nèi)主要的生糖前體，促進(jìn)丙酸的生成對(duì)提高反芻動(dòng)物生長性能具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，因此適當(dāng)提高暖季放牧牦牛的精料補(bǔ)飼水平能夠提高瘤胃菌體蛋白與丙酸濃度，進(jìn)而提高牦牛的生長性能，前期的研究中補(bǔ)飼Ⅲ組的平均日增重最高達(dá)到834.00 g［8］也驗(yàn)證了這一結(jié)果。

3.2 精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃細(xì)菌豐富度與多樣性的影響

16s rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)可以快速，高效地了解瘤胃微生物菌群的結(jié)構(gòu)與種類，因此通過該技術(shù)能夠全面了解精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃菌群的影響。Chao1 指數(shù)通常用來表示菌群豐富度指標(biāo)，其值越大表明菌群豐富度越大；香農(nóng)（Shannon）指數(shù)是衡量菌群多樣性的指標(biāo)，其值越大表明菌群多樣性越高。周力等［20］研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)飼精料降低了藏羔羊瘤胃細(xì)菌多樣性與豐富度。Liu 等［21］研究也發(fā)現(xiàn)，提高飼糧中精料比例，顯著降低了牦牛瘤胃細(xì)菌Chao1 和Shannon 指數(shù)。本研究中，隨著精料補(bǔ)飼水平的提高，牦牛瘤胃細(xì)菌OTU 數(shù)目和Alpha 多樣性指數(shù)下降，與以上研究結(jié)果相一致。

3.3 精料補(bǔ)飼水平對(duì)暖季放牧牦牛瘤胃細(xì)菌組成的影響

飼糧組成是影響反芻動(dòng)物瘤胃微生物的主要因素之一，飼糧精料水平會(huì)直接影響瘤胃微生物的組成與數(shù)目。有研究表明，擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）是反芻動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)菌門，擬桿菌門是降解碳水化合物的主要細(xì)菌，而厚壁菌門主要參與纖維物質(zhì)的分解，兩者在瘤胃發(fā)酵過程起著至關(guān)重要的作用［22-23］。本研究也得到相似的結(jié)果。林波等［24］用0∶100、35∶65 和50∶50 三種精粗比飼糧飼喂泌乳期水牛時(shí)發(fā)現(xiàn)，全粗料組瘤胃細(xì)菌擬桿菌門的豐度顯著低于其他兩組，而厚壁菌門的豐度顯著高于其他兩組。本研究中，隨著精料補(bǔ)飼水平的提高，牦牛瘤胃細(xì)菌擬桿菌門的豐度隨著上升，而厚壁菌門豐度隨著下降，與以上結(jié)果相似，說明補(bǔ)飼提高了牦牛瘤胃中非纖維降解菌的生長增殖。放線菌門（Actinobacteria）是一類革蘭氏陽性菌，具有分支的纖維和孢子，其大部分是腐生菌，也有寄生菌，可致?。?5］。本研究中，提高精料補(bǔ)飼水平能夠提高牦牛瘤胃放線菌門的豐度，表明生產(chǎn)中牦牛要適度補(bǔ)飼。

在屬水平上，普雷沃氏菌是反芻動(dòng)物瘤胃廣泛存在的菌屬，隸屬擬桿菌門，參與瘤胃內(nèi)的多種代謝活動(dòng)，主要降解日糧中的半纖維成分，具有高活性的半纖維降解功能，并且普雷沃氏菌產(chǎn)生大量的復(fù)合酶，促進(jìn)非纖維性多糖和蛋白質(zhì)的降解［26］。本研究中，牦牛瘤胃優(yōu)勢(shì)菌屬為普雷沃菌屬_1（Prevotella_1）、克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）和理研菌科_RC9（Gikenellaceae_RC9），這與張林［27］的研究結(jié)果相一致，與肖潤等［28］的研究不太一致。可能是動(dòng)物品種、生理階段、飼糧結(jié)構(gòu)和年齡不同等導(dǎo)致。高雨飛［11］研究發(fā)現(xiàn)，高精組錦江牛瘤胃普雷沃菌屬的豐度顯著高于粗料組，本研究結(jié)果與其基本一致，即隨著精料補(bǔ)飼水平的提高，牦牛瘤胃中普雷沃菌屬_1 和普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）的豐度隨著上升?？死锼闺茖儆诤癖诰T，對(duì)維持胃腸道結(jié)構(gòu)、功能和動(dòng)物機(jī)體免疫調(diào)節(jié)有著重要作用［29］。本研究中，瘤胃克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）的豐度隨著精料補(bǔ)飼水平的提高呈增加的趨勢(shì)，且補(bǔ)飼Ⅲ組顯著高于放牧組，說明適宜的精料補(bǔ)飼水平有助于提高暖季放牧牦牛的免疫力。有研究報(bào)道，解琥珀酸菌（Succiniclasticum）豐度與飼糧纖維成分有密切聯(lián)系，可以降解纖維或纖維二糖產(chǎn)生琥珀酸和乙酸等物質(zhì)［30］。本研究中，補(bǔ)飼顯著降低了牦牛瘤胃中解琥珀酸菌的豐度，可能原因是補(bǔ)飼提高了牦牛非纖維物質(zhì)的攝入量，增加了非纖維性多糖和蛋白質(zhì)的攝入量，進(jìn)而導(dǎo)致瘤胃中解琥珀酸菌豐度下降。瘤胃球菌屬主要包括黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌，能夠產(chǎn)生大量的纖維素酶，是主要的纖維分解菌［31］。張雪嬌等［32］研究發(fā)現(xiàn)，山羊瘤胃中瘤胃球菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）的豐度隨著飼糧NDF 水平提高而升高，本研究結(jié)果與其相似，說明提高精料補(bǔ)飼水平抑制了纖維降解菌的生長。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，精料補(bǔ)飼水平為2.5 kg·d-1時(shí)能促進(jìn)暖季放牧牦牛瘤胃發(fā)酵，降低細(xì)菌豐富度與多樣性；提高瘤胃擬桿菌門和放線菌門的豐度，但降低厚壁菌門的豐度；提高普雷沃菌屬_1、克里斯滕森菌科_R-7 和普雷沃氏菌科_UCG-001 的豐度，但會(huì)降低解琥珀酸菌屬的豐度。結(jié)果表明，適宜提高精料補(bǔ)飼水平能夠促進(jìn)暖季放牧牦牛瘤胃發(fā)酵，提高瘤胃部分淀粉降解菌的豐度，進(jìn)而提高其生長性能。