超聲輔助法提取酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷工藝優(yōu)化

宮 麗 劉 瑩 楊婷婷 王 輕 張彥青

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

酸棗仁是中國常用藥食同源品種之一[1-2]，在酸棗仁湯、棗仁安神方等肝血不足之失眠類的方劑、中成藥處方、食品和保健食品中被廣泛應(yīng)用[3-4]。酸棗仁黃酮是酸棗仁中的主要活性成分之一[5-7]，具有治療失眠[8]、改善認(rèn)知能力[9-10]、抗焦慮[11]、抗抑郁[12-15]等多種生物活性，其中，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷是酸棗仁黃酮的主要成分之一。異牡荊素—吡喃葡萄糖苷能夠明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞増殖，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[16]，在清除ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基等方面表現(xiàn)出較好的抗氧化活性[17]。此外，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的吸收特性優(yōu)于酸棗仁中的其他黃酮類物質(zhì)，如斯皮諾素、當(dāng)藥素等[18]，顯示出較好的體內(nèi)生物利用度特性。

目前黃酮類化合物的常見提取方法主要為浸提法、加熱回流法、超聲輔助提取等，由于浸提法耗時(shí)太長，加熱回流法又可能因?yàn)楦邷仄茐狞S酮類化合物的結(jié)構(gòu)[19-20]，所以超聲輔助提取技術(shù)受到越來越多的關(guān)注。超聲輔助提取法利用超聲傳播時(shí)所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)[21]，可以縮短提取時(shí)間，降低操作難度并且增加提取率[22-23]。乙醇加熱回流是當(dāng)前提取異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的主要方法[17]，目前有關(guān)超聲波輔助提取酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的研究尚未見報(bào)道。研究擬通過超聲輔助提取技術(shù)對酸棗仁黃酮單體異牡荊素—吡喃葡萄糖苷進(jìn)行提取，并運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝參數(shù)，以期為異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的深入開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

脫脂酸棗仁：天津薊縣；

異牡荊素—吡喃葡萄糖苷對照品：純度>95%，自制；

甲酸：色譜純，阿拉丁控股集團(tuán)有限公司；

乙腈：色譜純，德國Merck公司；

水：色譜純，美國J. T. Baker公司；

乙醇：分析純，美國J. T. Baker Chemicals公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗器：SB25-12 DTD型，寧波新芝生物科技有限公司；

高速萬能粉碎機(jī)：FW100型，天津泰斯特儀器有限公司；

高速離心機(jī)：LG10-2.4A型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DH-101型，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；

高效液相色譜儀：安捷倫1100型，安捷倫科技中國有限公司；

電子天平：FA1004Max 100 g 型，上海精科天平有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率測定

(1) 高效液相色譜條件：選擇ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速為0.5 mL/min；流動相為乙腈—水(含0.1%甲酸)混合液(V乙腈∶V水=18∶72)；柱溫30 ℃；檢測波長335 nm；進(jìn)樣量8 μL[24]。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取適量異牡荊素—吡喃葡萄糖苷對照品，用流動相(V乙腈∶V水=18∶72，不含甲酸)溶解，配制成1 mg/mL的溶液，依次稀釋得10，20，50，100，200，300 μg/mL的對照品溶液。以異牡荊素—吡喃葡萄糖苷溶液濃度為橫坐標(biāo)，所得峰面積為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.643 4x+15.093，R2=0.999。

(3) 牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的測定：按式(1)計(jì)算牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率[25]。

(1)

式中：

W——異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率，%；

c——對應(yīng)質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

D——稀釋倍數(shù)；

m——樣品取樣量，mg。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

(1) 超聲功率：固定提取溫度40 ℃、料液比1∶15 (g/mL)、超聲時(shí)間50 min，考察超聲功率(100，200，300，400，500 W)對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響。

(2) 超聲時(shí)間：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度40 ℃、料液比1∶15 (g/mL)、提取功率300 W，考察超聲時(shí)間(30，40，50，60，70 min)對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響。

(3) 料液比：固定提取溫度40 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取功率300 W、超聲時(shí)間50 min，考察料液比[1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)]對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響。

(4) 乙醇體積分?jǐn)?shù)：固定提取溫度40 ℃、料液比1∶15 (g/mL)、提取功率300 W、超聲時(shí)間50 min，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%，50%，60%，70%，80%)對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響。

(5) 超聲溫度：固定料液比1∶15 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取功率300 W、超聲時(shí)間50 min，考察提取溫度(30，40，50，60，70 ℃)對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)[26]，選擇超聲功率、料液比、超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)為響應(yīng)因素，以異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)以優(yōu)化異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的提取工藝，平行3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各指標(biāo)測定均重復(fù)3次，采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行顯著性分析，使用Prism 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲功率 由圖1(a)可知，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率隨超聲功率的增大先升高后降低，在超聲功率為400 W時(shí)最大，在超聲功率為500 W時(shí)下降至0.527%，可能是超聲波空化效應(yīng)和機(jī)械剪切力作用的增強(qiáng)有助于破碎藥材的細(xì)胞壁，促進(jìn)目標(biāo)物的溶出，而超聲功率過大會導(dǎo)致局部的高溫高壓，破壞異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的內(nèi)部結(jié)構(gòu)從而使提取率降低[27-28]。因此選擇超聲功率300～500 W為佳。

2.1.2 超聲時(shí)間 由圖1(b)可知，當(dāng)超聲時(shí)間為60 min時(shí)，提取率為0.634%，當(dāng)超聲時(shí)間為70 min時(shí)，提取率急劇降低至0.407%，可能是因?yàn)槌晻r(shí)間過短無法使目標(biāo)成分充分溶出，而超聲時(shí)間過長又會破壞異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[29]，從而使提取率降低。因此，超聲時(shí)間選擇50～70 min為宜。

圖1 各因素對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響

2.1.3 料液比 由圖1(c)可知，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率隨乙醇體積的不斷增加先升高后降低，當(dāng)料液比為1∶15 (g/mL)時(shí)提取率達(dá)到峰值0.604%。這可能是由于料液比的增加使原料與提取液間的接觸面積增大，從而提高溶出率；但料液比過高將稀釋提取液的濃度，且過多的提取液會分散超聲輻射對目標(biāo)組分的作用，使提取率降低，說明當(dāng)異牡荊素—吡喃葡萄糖苷濃度達(dá)最大值后，料液比的增加反而會使其濃度降低。因此，料液比選擇1∶10～1∶20 (g/mL)為宜。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù) 由圖1(d)可知，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高先升高后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)提取率最高，這可能與其溶解性有關(guān)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，酸棗仁粉末中的異牡荊素—吡喃葡萄糖苷未能完全溶解，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷溶出得更加完全，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)>70%時(shí)可能會破壞異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)，使提取率降低。故乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇60%～80%為宜。

2.1.5 超聲溫度 由圖1(e)可知，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率隨超聲溫度的升高先升高后降低，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)，提取率最高，可能是因?yàn)辄S酮類化合物具有一定的熱敏性[26]，適度的溫度有助于目標(biāo)物的溶出，而溫度過高則會破壞目標(biāo)物致使提取率下降。因此，超聲溫度選擇40～60 ℃為宜。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲功率、超聲時(shí)間、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)為響應(yīng)因素，以異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取工藝參數(shù)，試驗(yàn)因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 模型擬合和顯著性分析 通過Box-Benhnken試驗(yàn)擬合得出異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取工藝的回歸方程為：

Y=0.71+0.01A+0.013B+0.016C+0.02D-7.5×10-3AB-4.75×10-3AC-2.5×10-3AD+2.5×10-3BC-5.5×10-3BD+5.25×10-3CD-0.062A2-0.032B2-0.042C2-0.016D2。

(2)

由表3可知，回歸模型P值<0.000 1，極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.138 4不顯著，說明該試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，模型有意義[30]，可對二次回歸方程響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。一次項(xiàng)B、C、D，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率影響極顯著(P<0.01)，一次項(xiàng)A對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率影響顯著(P<0.05)，表明各因素及因素之間的交互與響應(yīng)值并非簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對響應(yīng)值的影響也較大，而各因素之間的交互作用對響應(yīng)值影響相對較小。比較F值可知，各因素對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響程度依次是D>C>B>A，該異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率回歸模型的相關(guān)系數(shù)較高(R2=0.972 8)，模型擬合程度好[31]。因此，可用此模型方程預(yù)測異牡荊素—吡喃葡萄糖苷超聲提取的結(jié)果。

表3 回歸模型方差分析?

2.2.3 交互效應(yīng)分析 由圖2可知，隨著各因素在一定范圍的增大，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取效果先升高后降低，各因素對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率影響顯著(P<0.05)，但各因素間的交互作用對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率影響不顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖2 兩兩因素交互作用對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率影響的響應(yīng)面圖

2.2.4 最佳提取率驗(yàn)證 由響應(yīng)面軟件分析得到異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的最佳提取工藝參數(shù)為超聲功率405 W，超聲時(shí)間62.30 min，料液比1∶15.75 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)76.3%，此條件下預(yù)測異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率為0.719%。為便于實(shí)際操作，將提取工藝條件修整為超聲功率405 W，超聲時(shí)間60 min，料液比1∶16 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，該條件下實(shí)測異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率為0.705%(n=3)，與預(yù)測值的相對誤差為2%，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)基本準(zhǔn)確可靠，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ湍茌^好反映出各因素與異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率之間的關(guān)系，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

采用超聲波對酸棗仁黃酮單體異牡荊素—吡喃葡萄糖苷進(jìn)行提取。結(jié)果表明，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的最佳提取工藝條件為超聲功率405 W，超聲時(shí)間60 min，料液比1∶16 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，該條件下異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率為0.705%(n=3)，與預(yù)測值(0.719%)接近，相對誤差為2%。后續(xù)可對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷進(jìn)行體內(nèi)外活性研究。