D-核糖對阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性的保護(hù)作用及機(jī)制研究

肖愛愛，王雪艷，溫 敏, ，王正平,2,3,

（1.聊城大學(xué)生物制藥研究院，山東聊城 252000；2.聊城高新生物技術(shù)有限公司，山東聊城 252000；3.海門品尚醫(yī)藥科技有限公司，江蘇南通 226133）

D-核糖（D-ribose，DR）是一種五碳醛糖，天然存在于所有生命細(xì)胞中，參與三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）的合成，在能量代謝中起重要作用[1]。D-核糖作為磷酸戊糖途徑的產(chǎn)物，有助于磷酸戊糖途徑的循環(huán)，增強(qiáng)氧化酶活性，快速清除自由基，提高機(jī)體氧化系統(tǒng)的防御能力[2?3]。目前，D-核糖作為一種新食品原料，已廣泛應(yīng)用于飲料、能量棒等多種食品加工中[4]。袁保輝等[5]和張振剛等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充D-核糖可以改善疲勞模型小鼠的心臟損傷，延長小鼠游泳時間并促進(jìn)疲勞小鼠體能恢復(fù)；臨床研究表明，D-核糖對慢性疲勞綜合征[6]、纖維肌痛[7]和充血性心力衰竭患者舒張功能障礙[8]等具有一定的改善作用。此外，已有研究表明：補(bǔ)充D-核糖可以改善大鼠心肌缺血再灌注損傷[9?10]。以上研究結(jié)果表明，D-核糖具有一定的心臟保護(hù)作用。

近年來，癌癥的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害人類的健康[11]。阿霉素（Doxorubicin，DOX）作為蒽環(huán)類化療藥物的代表，是目前臨床最常用的高效廣譜抗腫瘤藥物之一，但因嚴(yán)重的心臟毒性限制了其應(yīng)用[12]。研究表明，口服D-核糖對心臟具有保護(hù)作用，并能減輕順鉑介導(dǎo)的腎臟損傷[13]。然而，尚未見D-核糖對DOX 心臟毒性保護(hù)作用的報道。因此，本研究通過采用單次腹腔注射大劑量阿霉素（15 mg/kg）建立DOX 急性心臟毒性小鼠模型，通過檢測血清生化指標(biāo)和心臟組織病理變化評價D-核糖對DOX 心臟毒性的保護(hù)作用，并進(jìn)一步通過蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)揭示其潛在的分子機(jī)制，以期為DOX 心臟毒性的防治研究提供一定的參考和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

40 只ICR 雄性小鼠，8 周齡、體重25～30 g 濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司（中國濟(jì)南），實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK 魯2019-0003。所有小鼠均于溫度（23±2）℃、濕度（45%±10%）、12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)聊城大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號20200803）。

D-核糖 江西誠志生物工程有限公司；鹽酸阿霉素（純度≥98%，貨號：D807083） 上海麥克林生化科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；脂質(zhì)氧化（Malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、增強(qiáng)型ATP 檢測試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、總蛋白提取試劑盒 上海碧云天有限公司；脫脂奶粉（純度≥99%，貨號：D8340） 北京索萊寶科技有限公司；沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶類1（silent mating type information regulation 2 homolog 1，Sirt1）抗體 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛液、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體 武漢賽維爾生物科技有限公司；過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α，PGC-1α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinecontaining aspartate specific protease 3，Caspase-3）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、HRPGoat Anti-Rabbit IgG（H+L）、HRP-Goat Anti-Mouse IgG（H+L）抗體 Proteintech、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phophoate dehy-drogenase，GAPDH）抗體 Cell Signaling Technology。

Centrifuge 5804 R 高速臺式離心機(jī) 德國Eppendorf 公司；Tecan Spark?多功能酶標(biāo)儀 瑞士TECAN 公司；PowerPac HC 美國伯樂高流電泳儀電源、Mini-PROTEAN Tetra 小型垂直電泳槽、Trans-Blot SD 轉(zhuǎn)印槽 美國Bio-Rad 公司；Tanon-4600SF化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；OLYMPUS IX73 倒置顯微鏡 日本OLYMPUS。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為對照組（Con）、模型（DOX）組、D-核糖低劑量組（LDR）、D-核糖高劑量組（HDR），每組10 只。Con組、DOX 組灌胃給予生理鹽水（10 mL/kg），D-核糖低劑量組灌胃給予D-核糖（0.9 g/kg，10 mL/kg），D-核糖高劑量組灌胃給予D-核糖（1.8 g/kg，10 mL/kg），均連續(xù)給藥7 d。D-核糖的劑量選擇參考袁保輝等[5]的方法。在第8 d 灌胃結(jié)束后30 min，除對照組腹腔注射生理鹽水（5 mL/kg,下同）外，其余各組均腹腔注射DOX（15 mg/kg），期間小鼠全部存活。DOX 注射48 h 后處死小鼠，稱體重后摘眼球取血，血液樣本在室溫下保存30 min,4000 r/min 離心15 min，獲得用于生化分析的血清，并保存于?80 ℃冰箱備用。同時收集心臟組織并稱重，計算心臟指數(shù)。部分心臟用于組織病理檢測，部分置于?80 ℃保存，以便進(jìn)行后續(xù)分析。

心臟指數(shù)（mg/g）=心臟重量（mg）/體重（g）

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測 小鼠在給予DOX 處理48 h 后，摘眼球取血，分離血清并保存于?80 ℃冰箱備用。按照LDH 測定試劑盒說明書測定血清中LDH 水平。

1.2.3 心臟組織蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin stain，HE）染色 參考文獻(xiàn)[14]方法將心臟組織收集后置于4%多聚甲醛液中固定，48 h 后脫水、透明、浸石蠟，包埋，切片，進(jìn)行HE 染色，脫水封片后顯微鏡觀察心肌組織病理學(xué)變化。

1.2.4 心臟組織ATP 含量測定 稱取心臟組織，用ATP 檢測裂解液勻漿，制備10%組織勻漿。在4 ℃以12000 g 離心5 min，收集上清液，通過BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測定每個樣品的蛋白質(zhì)濃度。按照ATP 檢測試劑盒說明書測定心臟組織ATP 含量。

1.2.5 心臟氧化應(yīng)激水平分析 稱取心臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水勻漿，制備10%組織勻漿。在4 ℃以2500 r/min 離心10 min，收集上清液，通過BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測定每個樣品的蛋白質(zhì)濃度。嚴(yán)格按照試劑盒說明書，測定心臟組織內(nèi)T-SOD、CAT 活力和MDA 含量。

1.2.6 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平 用總蛋白提取試劑盒提取心臟組織總蛋白，并用BCA 法測定樣品蛋白濃度。隨后，取等量蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），使用聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別使用抗Sirt1、PGC-1α、Bax、Bcl-2、Caspase-3、GAPDH 抗體4 ℃孵育過夜；洗膜緩沖液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗膜后加入相應(yīng)的HRP-Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）、HRP-Goat Anti-Mouse IgG（H+L）二抗，室溫孵育2 h，采用ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。使用Image J 軟件對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，并將GAPDH 作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行量化。

1.2.7 免疫組織化學(xué)法檢測Caspase-3 表達(dá)水平組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)，3%的雙氧水處理阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉，加入兔源性Caspase-3 一抗4 ℃孵育過夜，次日加入山羊抗兔二抗室溫孵育，二氨基聯(lián)苯胺（3,3 N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察拍照。每只鼠選取3 張切片，應(yīng)用Image J 軟件進(jìn)行定量分析，取切片中陽性染色的面積占總面積的百分比作為Caspase-3 相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計作圖[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析并作圖，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey’s 檢驗(yàn)。其中，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重變化及心臟指數(shù)

由表1 可知，各組小鼠在進(jìn)行DOX 和D-核糖處理前體重并無明顯差異，而在進(jìn)行DOX 處理48 h后，DOX 組小鼠的體重較Con 組小鼠顯著降低（P＜0.05）。推測DOX 處理后小鼠體重顯著下降可能主要與小鼠攝食量下降有關(guān)。雖然D-核糖處理組小鼠體重高于DOX 組，但并無顯著差異（P＞0.05）。同時，各組小鼠處理后心臟指數(shù)無顯著差異（P＞0.05），這可能與小鼠心臟質(zhì)量變小，同時體質(zhì)量下降有關(guān)。

表1 各組小鼠干預(yù)前后體質(zhì)量變化及心臟指數(shù)比較Table 1 Comparison of body weight and heart index of each group before and after treatment

2.2 D-核糖對DOX 介導(dǎo)血清LDH 水平的影響

LDH 是常見心肌酶之一，在心肌受到損傷時，LDH 從受損的心肌細(xì)胞膜滲漏到血液中，是心臟毒性的標(biāo)志酶之一[16]。如圖1 所示，與Con 組比較，DOX 組小鼠血清中LDH 活性顯著升高（P＜0.05），表明DOX 組小鼠心肌組織損傷嚴(yán)重，DOX 誘導(dǎo)心臟毒性造模成功；D-核糖各處理組LDH 活性降低，且隨D-核糖劑量的增加而下降，HDR 組與DOX 組具有顯著性差異（P＜0.05）。這與劉平懷等[10]研究發(fā)現(xiàn)的D-核糖可以降低缺血性心肌梗塞大鼠模型LDH 活性，改善心功能的結(jié)果一致。

圖1 小鼠血清LDH 水平Fig.1 Contents of LDH in serum

2.3 D-核糖對DOX 介導(dǎo)心臟組織病理學(xué)的影響

組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DOX 可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生空泡變性、心肌間隙增寬等病理改變[14,17]。如圖2 所示，Con 組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，無明顯組織病理學(xué)損傷。DOX 組心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡變性，心肌細(xì)胞間隙明顯增寬，表明模型建立成功。與DOX 組相比，LDR 組沒有明顯變化，HDR 組心肌細(xì)胞內(nèi)可見空泡變性、心肌細(xì)胞間隙減少，心肌組織病理學(xué)損傷有明顯改善。綜上所述，D-核糖能使DOX 處理小鼠心臟組織形態(tài)趨于正常化，具有一定心臟保護(hù)作用。

圖2 各組小鼠心臟組織切片病理學(xué)觀察（HE，100 μm）Fig.2 Pathological observation of hematoxylin-eosin stain sections of heart biopsy (HE,100 μm)

2.4 D-核糖對DOX 介導(dǎo)心臟ATP 水平的影響

DOX 可導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體腫脹和電子傳遞鏈的解偶聯(lián)[18?19]，降低心肌細(xì)胞內(nèi)ATP 水平（20%～50%），誘發(fā)心肌損傷[20?21]。Tang 等[22]研究表明，提高心肌組織內(nèi)ATP 水平，可以顯著改善DOX 介導(dǎo)的心臟損傷（P＜0.05）。如圖3 所示，與Con 組比較，DOX 可顯著降低心臟組織內(nèi)ATP 含量（P＜0.05）；與DOX 組比較，LDR 組ATP 含量有一定升高，但無顯著性差異（P＞0.05），而HDR 組ATP 含量顯著升高（P＜0.05）。王亞坤等[23]研究發(fā)現(xiàn)D-核糖能夠補(bǔ)充運(yùn)動過程中消耗的ATP，對大鼠運(yùn)動后心臟功能的恢復(fù)具有一定的作用。以上結(jié)果表明，D-核糖可能通過快速補(bǔ)充ATP，改善小鼠的心臟功能。

圖3 各組小鼠心臟組織ATP 含量比較Fig.3 Comparison of ATP content in heart tissues of mice in each group

2.5 D-核糖對DOX 介導(dǎo)心臟氧化應(yīng)激的影響

研究表明DOX 介導(dǎo)的心臟毒性與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[24]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物增加、DNA損傷和線粒體功能障礙，引發(fā)細(xì)胞死亡[25?26]。吳文英等[27]和Zhao 等[28]研究發(fā)現(xiàn)抑制氧化應(yīng)激，可以減輕DOX 心臟毒性。如圖4 所示，與Con 組比較，DOX可顯著增加心臟組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 的含量（P＜0.05），并降低心臟組織抗氧化酶T-SOD、CAT 活力（P＜0.05）；與DOX 組比較，LDR 組MDA含量有一定下降，T-SOD、CAT 活力有一定升高，但均無顯著性差異（P＞0.05），而HDR 組MDA 含量顯著下降，T-SOD、CAT 活力顯著升高（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，D-核糖可通過抑制DOX 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷減輕其心臟毒性。

圖4 各組小鼠心臟組織MDA、CAT、T-SOD 水平比較Fig.4 Comparison of MDA,CAT and T-SOD in heart tissue of mice in each group

2.6 D-核糖對DOX 介導(dǎo)心臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

研究表明細(xì)胞凋亡是DOX 心臟毒性的重要機(jī)制之一，抑制細(xì)胞凋亡能夠有效改善DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性[29?30]。Bcl-2/Bax 比值降低啟動細(xì)胞凋亡，并由Caspase-3 蛋白執(zhí)行細(xì)胞凋亡。本研究中，如圖5 Western blot 結(jié)果所示，與Con 組小鼠相比，DOX 可顯著增加小鼠心肌組織內(nèi)促凋亡蛋白Bax、Capsase-3的表達(dá)水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)水平（P＜0.05）；與DOX 組相比，LDR 組Bax、Capsase-3 表達(dá)水平有一定降低，Bcl-2 表達(dá)水平有一定升高，但無顯著性差異（P＞0.05）；而HDR 組Bax、Capsase-3 表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。此外，Caspase-3 免疫組織化學(xué)結(jié)果如圖5B、E 所示，與Con 組相比，DOX 組中Caspase-3 蛋白陽性表達(dá)增強(qiáng)（棕色）。與DOX 組比較，LDR 組Caspase-3 蛋白陽性表達(dá)無明顯變化，而HDR 組Caspase-3 蛋白陽性表達(dá)明顯降低。以上結(jié)果顯示，D-核糖對DOX 心臟損傷的保護(hù)作用可能與其抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)。

圖5 各組小鼠心臟組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.5 Expression of apoptosis-related proteins in heart tissues of different group of mice

2.7 D-核糖對Sirt1/PGC-1α 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)，激活Sirt1/PGC-1α通路，可以降低心臟氧化應(yīng)激和線粒體損傷，緩解DOX 誘導(dǎo)的急性心臟毒性[31?33]。如圖6 所示，與Con 組相比，DOX顯著降低Sirt1、PGC-1α表達(dá)水平（P＜0.05）；與DOX組相比，LDR 組Sirt1、PGC-1α無顯著變化（P＞0.05），而HDR 組Sirt1、PGC-1α表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。綜上所述，推測D-核糖可能通過激活Sirt1/PGC-1α信號通路，提高ATP 水平，改善心肌組織能量代謝；同時抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對DOX 介導(dǎo)心臟毒性發(fā)揮保護(hù)作用。

圖6 各組小鼠心臟組織Sirt1/PGC-1α 通路表達(dá)情況Fig.6 Sirt1/PGC-1α pathway expression in heart tissues of different group of mice

3 討論與結(jié)論

DOX 誘導(dǎo)心臟毒性的機(jī)制較為復(fù)雜，尚未完全闡明，可能與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、自噬等相關(guān)[34?35]。心臟是機(jī)體主要的耗能器官之一，線粒體是心肌能量產(chǎn)生和儲存的主要場所，心臟損傷時線粒體功能改變導(dǎo)致ATP 生成減少，ATP 水平是評價心肌損傷的標(biāo)志之一[36]。本研究中，與Con 組相比，DOX 組小鼠心臟組織中ATP 水平顯著降低（P＜0.05），提示心肌損傷；與DOX 組相比，HDR 干預(yù)小鼠心臟中ATP 水平顯著升高（P＜0.05），LDR 組ATP 水平雖然表現(xiàn)出升高的趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05），表明HDR 可能通過改善線粒體能量代謝改善DOX 介導(dǎo)的心肌損傷。

大量研究表明，DOX 進(jìn)入細(xì)胞后代謝產(chǎn)生過量的ROS，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2/凋亡蛋白Bax，觸發(fā)線粒體依賴的細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞凋亡能夠有效改善DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性[29?30]。本研究中，與Con 相比，DOX 組小鼠心臟中T-SOD、CAT 活力顯著降低（P＜0.05），MDA 含量顯著增加（P＜0.05），提示氧化應(yīng)激發(fā)生；同時，DOX 顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達(dá)（P＜0.05），下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)，提示線粒體依賴的細(xì)胞凋亡發(fā)生。HDR 干預(yù)小鼠后，心臟中T-SOD、CAT 活力顯著升高（P＜0.05），MDA 水平顯著性降低（P＜0.05），這與之前的研究一致[3,37]。此外，與DOX 組相比，HDR干預(yù)顯著下調(diào)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達(dá)（P＜0.05），上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)，但LDR 干預(yù)對上述指標(biāo)無顯著性影響（P＞0.05）。以上結(jié)果提示，D-核糖干預(yù)可能通過緩解DOX 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激抑制線粒體依賴的細(xì)胞凋亡，且具有一定的劑量效應(yīng)。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）是一種煙酰胺腺苷二核苷酸（NAD+）依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、線粒體功能等，在DOX 介導(dǎo)的心臟毒性中發(fā)揮重要的保護(hù)作用[38?39]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）是線粒體生物合成、氧化代謝及細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控分子，在心臟代謝和功能發(fā)揮中起重要作用[22,29]。Liu 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，紫檀茋通過激活Sirt1/PGC-1α通路，降低心臟氧化應(yīng)激和線粒體損傷，緩解DOX誘導(dǎo)急性心臟毒性。與前述一致，本研究發(fā)現(xiàn)DOX顯著下調(diào)Sirt1、PGC-1α的表達(dá)。與DOX 組相比，HDR 干預(yù)顯著上調(diào)Sirt1、PGC-1α的蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），但LDR 干預(yù)對Sirt1、PGC-1α表達(dá)無顯著性影響（P＞0.05）。結(jié)果表明，HDR 可能通過激活Sirt1/PGC-1α通路調(diào)控線粒體功能（ATP 產(chǎn)生和抗氧化），且具有一定的劑量效應(yīng)。

本研究初步探究了D-核糖對DOX 介導(dǎo)急性心臟毒性的保護(hù)作用。高劑量D-核糖干預(yù)可顯著提高心肌組織中ATP 含量，緩解心肌氧化應(yīng)激，抑制線粒體依賴的細(xì)胞凋亡，說明改善心肌細(xì)胞線粒體功能可能是D-核糖保護(hù)DOX 介導(dǎo)心肌損傷的重要機(jī)制之一。進(jìn)一步的機(jī)制研究揭示，D-核糖對線粒體功能的改善作用與其激活Sirt1/PGC-1α信號通路有關(guān)。然而，D 核糖干預(yù)對DOX 心臟毒性最佳保護(hù)效果的劑量值得進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為D-核糖在心血管疾病和腫瘤患者營養(yǎng)配方食品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，有利于促進(jìn)D-核糖在臨床營養(yǎng)領(lǐng)域以及我國特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品行業(yè)的發(fā)展。