于博馳，張克誠，施李鳴, 楊淼泠，呂朝陽，葛蓓孛

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

武夷菌素是從不吸水鏈霉菌武夷變種StreptomycesalbulusCK-15代謝產(chǎn)物中分離得到的一種廣譜、高效和低毒的農(nóng)用抗生素[1]，對蔬菜、果樹等多種作物真菌病害防治效果明顯，可有效防治黃瓜白粉病、番茄葉霉病等真菌病害，同時對作物生長還有一定的促進(jìn)作用[2]，并以其良好的防治效果在農(nóng)業(yè)上得到了廣泛的應(yīng)用，創(chuàng)造了良好的社會和經(jīng)濟(jì)效益[3]。武夷菌素毒性測定結(jié)果表明其毒性分級為低毒類，對人、畜低毒，對環(huán)境生物安全。孫延忠對武夷菌素的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果表明它可以改變菌絲體細(xì)胞膜的透性和抑制菌絲蛋白質(zhì)的合成，破壞菌絲體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成菌絲原生質(zhì)滲漏，致使菌絲畸形生長，從而降低病原菌的致病力，同時能夠誘導(dǎo)植株對病原菌產(chǎn)生抗性，從而達(dá)到防治病害的效果[4]。

微生物源農(nóng)藥按成分可分為活體[5]和代謝產(chǎn)物[6]兩類。代謝產(chǎn)物類農(nóng)藥包括中生菌素[7]、井岡霉素[8]、阿維菌素[9]等，活體微生物農(nóng)藥主要包括金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae[10]、球孢白僵菌Beauveria bassiana[11]、綠色木霉Trichodermaviride[12]、哈茨木霉Trichodermaharzianum[13]和淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus[14]等。在實際使用過程中，由于在植物的不同生長時期，或者同一時期發(fā)生的不同病害必然導(dǎo)致在同一株植株上使用不同的微生物農(nóng)藥，那么這些代謝產(chǎn)物類農(nóng)藥與活體微生物農(nóng)藥之間的相互影響目前還沒見相關(guān)的報道，值得進(jìn)一步研究討論。

本研究以牛津杯抑菌測試法[15]探究武夷菌素對球孢白僵菌，金龜子綠僵菌的影響，以菌絲生長抑制法[16]探究武夷菌素對綠色木霉、哈茨木霉、淡紫擬青霉菌絲生長率的影響，本研究對指導(dǎo)武夷菌素及活體微生物農(nóng)藥的田間用藥，為生物防治技術(shù)集成提供理論基礎(chǔ)，具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

淡紫擬青霉Paecilomyceslilacinus（Thorn.）Samson：山東綠隴生物技術(shù)有限公司提供；綠色木霉Trichodermaviride：微元生物有限公司提供；金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae2-2和球孢白僵菌Beauveriabassiana105：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所草地植保實驗室提供；哈茨木霉Trichoderma harzianum：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物防治研究室提供。

1.2 供試試劑和培養(yǎng)基

高保真KOD-plus DNA聚合酶購自日本TOYOBO公司；真菌DNA提取緩沖液：量取5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），2 mL 5 mol/L氯化鈉，0.4 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），5 mL 20% SDS，加ddH2O定容到 50 mL混勻；武夷菌素發(fā)酵液：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)用抗生素組保存并提供。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（煮汁）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g；武夷菌素發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉30 g，黃豆粉20 g，葡萄糖20 g，氯化銨4 g，碳酸鈣3 g。

1.3 試驗儀器

Tanon-1600型凝膠成像儀，購自上海天能科技有限公司；Sigma 1-14型離心機(jī)，購自德國Sigma公司；RS-232型搖床，購自上海智城分析儀器制造有限公司；DYY-6C型電泳儀，購自北京市六一儀器廠；Sigma 1-14型離心機(jī)，購自德國Sigma公司；DW-86W100型超低溫冰箱，購自青島海爾特種電器有限公司；牛津杯內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm；索尼數(shù)碼相機(jī)，型號Sony DSC-T1。

1.4 武夷菌素對真菌孢子類的抑制

1.4.1 武夷菌素發(fā)酵液的制備 真菌懸浮液的制備：將真菌在PDAY培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線，28 ℃培養(yǎng)72 h，用蒸餾水4 mL將孢子洗下來，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｎ湟木氐闹苽洌簩⒔臃N的武夷菌素發(fā)酵培養(yǎng)基放置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)64 h，濾紙過濾，再濃縮5倍，進(jìn)行高效液相色譜效價測定，為20275 mg/L。

1.4.2 抑菌試驗步驟 待制備好的PDA培養(yǎng)基冷卻至40 ℃左右，往錐形瓶中加入保存好的菌液100 μL，搖勻；倒平板，每板倒入15 mL培養(yǎng)基；將武夷菌素用蒸餾水稀釋至2000 mg/L，1500 mg/L，1000 mg/L，500 mg/L備用；用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，吸取250 μL不同濃度武夷菌素加至牛津杯中，每組3個重復(fù)，放置28 ℃恒溫培養(yǎng)，注意操作過程中不要將菌懸液溢出牛津杯外。待平板中開始形成清晰抑菌圈時進(jìn)行測量，用十字測量法通過DIGITAL CALIPER電子數(shù)量游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量，每組3個重復(fù)，每個平板抑菌圈用十字交叉法進(jìn)行測量，最終取6個數(shù)據(jù)的平均值，記錄試驗數(shù)據(jù)。

1.4.3 測量最小抑菌濃度 在500～2000 mg/L抑菌圈的測量數(shù)據(jù)上，再次以不同武夷菌素濃度處理，找到生防菌的最小抑菌濃度（MIC），即能產(chǎn)生透明抑菌圈的最小抑菌劑濃度定為MIC，其判定標(biāo)準(zhǔn)為：在該濃度下抑菌圈直徑大于或等于牛津杯直徑[17]。

1.5 武夷菌素對真菌菌絲生長率的抑制

1.5.1 菌絲生長速率法測試步驟 在工作臺無菌條件下用過濾薄膜過濾武夷菌素20 mL于離心管中待用。將100 mL規(guī)格PDA培養(yǎng)基放置微波爐加熱，待冷至40 ℃時加入已除菌的武夷菌素分別為1.25 mL（25 mg/L），2.5 mL（50 mg/L），3.5 mL（75 mg/L）和5 mL（100 mg/L），將已加入除菌武夷菌素的PDA培養(yǎng)基混合均勻，倒板，每個平板15 mL，靜置冷卻，每組安排3個重復(fù)；在培養(yǎng)72 h后的金龜子綠僵菌、球孢白僵菌、淡紫擬青霉菌落的相同直徑上用打孔器打菌餅并接到已冷卻的含藥培養(yǎng)基中心，在28 ℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)。在真菌的生長過程中總共測3次，待對照組培養(yǎng)基中真菌長滿整個培養(yǎng)基平板時為最后一次，用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值并計算抑菌率。抑制率＝（對照組菌落直徑―試驗組菌落直徑）/對照組菌落直徑

1.5.2 測量最小抑菌濃度 在25～100 mg/L菌絲生長速率法的測量數(shù)據(jù)上，再次細(xì)分不同的武夷菌素濃度，找到3種生防真菌的最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 武夷菌素對真菌孢子的抑菌結(jié)果分析

武夷菌素對生防菌細(xì)菌和真菌孢子的抑制試驗結(jié)果顯示：武夷菌素在高濃度處理下（500～2000 mg/L）對球孢白僵菌的抑制作用顯著大于金龜子綠僵菌在低濃度武夷菌素處理下。武夷菌素對生防菌真菌孢子的最小抑制濃度測定結(jié)果顯示：球孢白僵菌的最小抑菌濃度為400 mg/L，金龜子綠僵菌的最小抑菌濃度為200 mg/L，這可能是由于受到金龜子綠僵菌抑菌圈邊界不夠清晰的問題的影響（表1）。

表1 抑菌圈法測定不同濃度梯度武夷菌素對球孢白僵菌和金龜子綠僵菌的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic zone method to determine the antibacterial effect of different concentration gradient Wuyiencin on B.bassiana and M.anisopliae.

在實際應(yīng)用中，金龜子綠僵菌防治范圍廣，可防治8目30科200余種害蟲。主要用于防治金龜子、象甲、金針蟲、蛾蝶幼蟲、蝽和蚜蟲等害蟲。球孢白僵菌主要用于防治松毛蟲、玉米螟、蠐螬、蝗蟲、茶小綠葉蟬、蚜蟲、飛虱等害蟲，采用噴粉的施用方式；武夷菌素用于防治多種作物上的白粉病、葉霉病、流膠病、病毒病、瘡痂病，采用直接藥液噴霧形式；存在與金龜子綠僵菌和球孢白僵菌同時使用的情況，可能影響田間防效，建議應(yīng)錯開使用。

2.2 武夷菌素對真菌菌絲生長率的抑制結(jié)果分析

武夷菌素100 mg/L濃度對三種真菌的抑制率分別為64.6%、48.6%和39.2%，抑制率由高到低分別為綠色木霉，哈茨木霉，淡紫擬青霉。而武夷菌素對綠色木霉、哈茨木霉、淡紫擬青霉最低抑制濃度測試表明，即使是極低濃度武夷菌素（6.25 mg/L）同樣對綠色木霉、哈茨木霉、淡紫擬青霉存在抑制，抑制率分別為4.3%、4.1%和6.3%。因此實際生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)避免武夷菌素與綠色木霉、哈茨木霉、淡紫擬青霉同時使用，以免影響藥效（圖1～4）。

圖1 武夷菌素對三種真菌的抑制率Fig.1 Inhibition rate of wuyiencin on three fungi

圖2 武夷菌素處理綠色木霉菌絲體抑制效果圖Fig.2 The inhibitory effect of wuyiencin on T.viride

圖3 武夷菌素處理哈茨木霉菌絲體抑制效果圖Fig.3 The inhibitory effect of wuyiencin on T.harzianum

圖4 武夷菌素處理淡紫擬青霉菌絲體抑制效果圖Fig.4 The inhibitory effect of wuyiencin on P.lilacinus

對抑制率進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到武夷菌素對綠色木霉，哈茨木霉，淡紫擬青霉的毒力回歸方程及 EC50值，結(jié)果表明武夷菌素對綠色木霉的EC50為57.13 mg/L，哈茨木霉的EC50為109.81 mg/L，淡紫擬青霉的EC50為170.03 mg/L（表2）。

表2 武夷菌素對三種真菌的毒力回歸方程及EC50Table 2 The virulence regression equation and EC50 of wuyiencin to three fungi

淡紫擬青霉主要用于防治田間和溫室內(nèi)蔬菜、果樹、花卉等農(nóng)作物的白粉病、灰霉病、霜霉病、葉霉病、葉斑病等葉部真菌性病害，采用藥液噴霧的形式[18]。而武夷菌素主要用于防治多種作物上的白粉病、葉霉病、流膠病、病毒病、瘡痂病，同樣是采用直接藥液噴霧形式。兩種農(nóng)藥同時使用，可能影響淡紫擬青霉的防效，建議應(yīng)錯開使用。

在田間實際應(yīng)用中綠色木霉[19]和哈茨木霉都主要是采用拌種或與肥料混合施用于土壤，分別用于防治土傳性病害和各種線蟲病害。與武夷菌素的使用幾乎不存在重疊，不需要考慮相互影響效果。

3 討論

在球孢白僵菌和金龜子綠僵菌的抑菌試驗中發(fā)現(xiàn)隨著試驗進(jìn)行，同時抑菌圈的直徑也在發(fā)生變化，試驗數(shù)據(jù)采取的是抑菌圈的最大直徑。從球孢白僵菌不同時期的抑菌圈圖片可以明顯看出抑菌圈的直徑是隨著時間的增長逐漸變小，在2000 mg/L高濃度處理下，即使在72 h仍保持一個較小的邊界清晰的抑菌圈，而在1000 mg/L低濃度的處理下，隨著時間的延長，72 h抑菌圈逐漸變得不明顯。推測分析造成試驗結(jié)果的原因有兩點：一是由于隨著時間增長，真菌孢子的生長及新陳代謝消耗了培養(yǎng)基中部分的武夷菌素，從而導(dǎo)致抑菌圈減??；二是由于真菌孢子在武夷菌素的處理下自身產(chǎn)生了耐性或者是抗性從而導(dǎo)致抑菌圈減小甚至消失。

根據(jù)不同濃度武夷菌素處理的綠色木霉、哈茨木霉、淡紫擬青霉的平板照片，發(fā)現(xiàn)隨著武夷菌素處理濃度升高，菌絲體呈現(xiàn)出增厚的現(xiàn)象，以適應(yīng)武夷菌素的抑制。而根據(jù)試驗獲得的綠僵菌平板照片可以看出抑菌圈邊界模糊不確定，推測綠僵菌對武夷菌素產(chǎn)生一定的抗性，有部分孢子可在武夷菌素條件下生長繁殖。

本試驗僅在離體條件下測得武夷菌素對活體微生物的抑制率，根據(jù)最小抑菌濃度得出初步結(jié)論。在時間和試驗條件允許的情況下，應(yīng)進(jìn)一步安排田間試驗進(jìn)行驗證。