付國輝， 黃麗杰， 岳 磊， 劉娜娜， 閆懿高

(1.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，鄭州 451191；2.鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450000)

蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲TyphaangustifoliaL.、東方香蒲TyphaorientalisPresl或同屬植物的干燥花粉[1]。臨床多用于吐血、衄血、咯血、崩漏、外傷出血、經(jīng)閉通經(jīng)、胸腹刺痛、跌撲腫痛[2]、血淋澀痛[3]等病癥。蒲黃主產(chǎn)于我國江蘇、浙江、安徽、山東、河南、湖北、內(nèi)蒙古、黑龍江等地[4]?！吨袊幍洹芬?guī)定同屬多種植物的花粉皆可作中藥使用，因此蒲黃資源極其豐富[5]。蒲黃的性狀為粉質(zhì)，無臭無味，性狀特征不明顯[6]，易摻假，因此對(duì)蒲黃的質(zhì)量應(yīng)嚴(yán)格把控。蒲黃的有效成分多為黃酮類、止血成分鞣質(zhì)、甾類、烷烴類、糖類等[7]。近年來，對(duì)蒲黃的化學(xué)成分、藥理活性及臨床應(yīng)用研究逐漸深入[8-13]。參考2020年版《中國藥典》一部蒲黃的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷為含量測(cè)定項(xiàng)下的兩個(gè)指標(biāo)性成分，本研究主要對(duì)不同來源處的蒲黃中這兩種指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定并比較，考察其差異性，為臨床評(píng)價(jià)和鑒定蒲黃提供參考。

1 儀器、試劑與藥材

1.1 儀器 高效液相色譜儀為Agilent1260，二極管陣列檢測(cè)器(國安捷倫科技有限公司)；XS205十萬分之一電子分析天平(METTLER TOLEDO)；水浴鍋型號(hào)HH-S(鞏義市英峪予華儀器廠)。

1.2 試劑與藥材 娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈均為色譜純(Merck公司)；磷酸(含量98%，AR，洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司)；異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：111571-201806，含量以93.0%計(jì))、香蒲新苷對(duì)照品(批號(hào)：111573-201806，含量以96.5%計(jì))均來自中國食品藥品檢定研究院；蒲黃藥材來源及含量測(cè)定結(jié)果見表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[1]色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液(15:85)；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；理論板數(shù)：按異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰計(jì)，應(yīng)不低于5 000。

2.2 供試品溶液的制備 取不同來源處的蒲黃約0.5 g，精密稱定，放置于具塞的錐形瓶中，加甲醇50 mL，精密稱定重量，冷浸12 h，加熱回流1 h，取出，放至室溫，精密稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻后濾過，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 取異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品約10 mg，精密稱定后置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品溶液；同法制得香蒲新苷對(duì)照品溶液。

3 方法學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證

分析方法驗(yàn)證的目的是證明建立的方法適合于相應(yīng)檢測(cè)要求[14]。驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)有專屬性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度等，通過各種驗(yàn)證證明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3.1 專屬性試驗(yàn)的驗(yàn)證 按照“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液和陰性對(duì)照溶液(無樣品，其余實(shí)驗(yàn)操作完全一致)，按照“2.3”項(xiàng)下制備對(duì)照品溶液，取混合流動(dòng)相溶液作為空白溶液，按照“2.1”項(xiàng)下，吸取空白溶液、陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL(儀器自主精密吸取)注入色譜儀，查看圖譜并記錄譜峰的面積。見圖1-4。色譜圖中色譜基線穩(wěn)定，供試品溶液中兩個(gè)化合物香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷色譜峰與鄰近色譜峰分離度良好，空白溶液和陰性對(duì)照溶液色譜圖顯示均無干擾。

3.2 重復(fù)性試驗(yàn)的驗(yàn)證 精密稱取蒲黃樣品(編號(hào)10)，按照“2.2”項(xiàng)下平行制備6份樣品溶液，精密吸取6份平行樣品，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄2個(gè)指標(biāo)性化合物異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的色譜峰面積并計(jì)算其含量。異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷含量的RSD值分別為0.5%和0.6%，表明該方法驗(yàn)證良好，該方法重復(fù)性良好。

3.3 精密度試驗(yàn)的驗(yàn)證 在不同日期，使用不同的高效液相色譜儀器和不同的色譜柱[1.見“2.1”項(xiàng)下的色譜條件；2.美國沃特世公司的Waters Alliance e2695型高效液相色譜儀，2489 UV/Vis Detecter，色譜柱：Welch Ultimate LP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；3.賽默飛世爾科技有限公司 DIONEX U-3000，UltiMate 3000 Variable Wavelength Detector，色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 Analytical(4.6 mm×250 mm，5 μm)]，由不同的實(shí)驗(yàn)人員按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下相同的方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入高效液相色譜儀，記錄2個(gè)指標(biāo)性化合物的色譜峰面積，并計(jì)算其含量，考察驗(yàn)證該方法的中間精密度。結(jié)果顯示，香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值分別顯示為0.5%和0.6%、0.5%和0.4%、0.6%和0.3%。驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法中間精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)的驗(yàn)證 精密稱取蒲黃樣品(編號(hào)10)，按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行樣品溶液的制備，分別在0、2、4、8、12、24和48 h時(shí)注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積并計(jì)算其含量，香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的峰面積的RSD值顯示為0.5%和0.9%，含量的RSD值分別為0.3%和0.4%，驗(yàn)證結(jié)果證明，溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定可使用，驗(yàn)證結(jié)果表明，可以作為穩(wěn)定的供試品溶液進(jìn)行試驗(yàn)。

3.5 加樣回收率試驗(yàn)的驗(yàn)證 精密稱取6份相同重量的已知含量的蒲黃樣品(編號(hào)10)，按1∶1的比例精密加入與已知含量蒲黃樣品相同比例含量的兩種化合物的對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行供試品溶液的制備，按照“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣，記錄譜峰，測(cè)定6份供試品溶液中異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的含量，計(jì)算回收率。異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的平均回收率分別為102%和99%，RSD值分別為1.4%和0.8%。試驗(yàn)證明該方法的加樣回收率符合要求，該方法的準(zhǔn)確度良好。

4 實(shí)驗(yàn)測(cè)定及結(jié)果

4.1 測(cè)定法 取異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的對(duì)照品溶液及供試品溶液，注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣量均為20 μL，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)法分別計(jì)算含量。色譜圖見圖1-4。

圖2 異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品色譜

圖3 香蒲新苷對(duì)照品色譜

圖4 編號(hào)10的樣品色譜

4.2 理論板數(shù) 按異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰計(jì)算均未低于5 000。

4.3 樣品測(cè)定結(jié)果 見表1。

5 討論

5.1 蒲黃藥材摻偽品現(xiàn)象及非法添加 由于蒲黃的藥用標(biāo)準(zhǔn)為同屬多種植物的花粉，范圍較大，雖藥用資源較為豐富，但蒲黃花粉為粉質(zhì)，無臭無味，曾有因外觀類同而誤用的事故發(fā)生，如以松花粉誤以蒲黃使用。蒲黃藥材極易出現(xiàn)摻偽品，常見有摻入淀粉、礦物質(zhì)細(xì)粉，甚至出現(xiàn)用礦物質(zhì)細(xì)粉加黃色染料偽制蒲黃的現(xiàn)象，因此在蒲黃藥材的檢驗(yàn)中增加了檢查非法添加物金胺O的項(xiàng)目。蒲黃的質(zhì)量問題還有摻雜，在蒲黃的生產(chǎn)過程中不可避免會(huì)帶入原本來自香蒲雄花序的雜質(zhì)，而《中國藥典》規(guī)定雜質(zhì)限度為不得超過10.0%，且因蒲黃藥材性狀的特殊性，人為區(qū)分蒲黃和雜質(zhì)較困難，因此關(guān)于雜質(zhì)檢驗(yàn)的相應(yīng)問題，需要進(jìn)一步研究解決。劉亞萍等[15]研究了蒲黃凈制前后，蒲黃樣品中黃酮類化合物含量的變化情況，結(jié)果表明，蒲黃樣品經(jīng)過七號(hào)篩凈制后，花粉粒中所含的黃酮類化合物成分含量最高。

5.2 蒲黃藥理作用研究進(jìn)展 蒲黃所含化學(xué)成分眾多，主要有黃酮、有機(jī)酸、烷烴、揮發(fā)油等，此外還含有無機(jī)元素及其他化學(xué)物質(zhì)[16]。蒲黃中藥理作用的主要成分為黃酮類，黃酮類成分中的黃酮醇類含量相對(duì)較高，主要以化合物香蒲新苷和化合物異鼠李素-3-O-新橙皮苷為主[17-18]。在止血方面，陳佩東等[19]的研究結(jié)果顯示，包括香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷在內(nèi)的6種黃酮類化合物均可使家兔體外血漿凝血酶原時(shí)間和血漿凝血酶時(shí)間縮短；在化瘀方面，對(duì)于蒲黃具有的化瘀行滯、祛瘀止痛的作用，馮緒強(qiáng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)，60%乙醇洗脫部位鎮(zhèn)痛作用顯著，對(duì)其進(jìn)行的化學(xué)成分分析顯示有黃酮苷類、香蒲新苷等；在通淋方面，蒲黃可利尿通淋，多用于血淋、小便淋澀疼痛而有尿血者[21]。蒲黃顯示的多種藥理作用使其在臨床應(yīng)用上備受青睞，因此對(duì)其質(zhì)量的把控應(yīng)更為嚴(yán)謹(jǐn)。

5.3 流動(dòng)相選擇及探索 通過查閱現(xiàn)有文獻(xiàn)[22-26]及探索，本實(shí)驗(yàn)考查了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸和甲醇-0.4%磷酸等流動(dòng)相，考察結(jié)果顯示，最佳流動(dòng)性條件還是以《中國藥典》蒲黃含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件中的乙腈-0.05%磷酸溶液(15:85)為最優(yōu)，具有試劑經(jīng)濟(jì)易得、溶液易配制、色譜基線穩(wěn)定、出峰時(shí)間適宜等優(yōu)點(diǎn)。

5.4 結(jié)果分析 由表1含量測(cè)定結(jié)果可知，《中國藥典》規(guī)定蒲黃按干燥品計(jì)算，含異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的總量不得少于0.50%。實(shí)驗(yàn)所用16批藥材中異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的總量均大于0.50%，說明藥材良好。除編號(hào)16中異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量和香蒲新苷含量相差較大之外，其余批次兩種化合物的含量差別不大；不同批次之間異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量和香蒲新苷的含量有差異，編號(hào)11中異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的總量最低，編號(hào)16總含量最高，差異產(chǎn)生的原因可能有多個(gè)。地域分布和品種差異，水燭香蒲主產(chǎn)于江蘇、浙江、山東和安徽等地，東方香蒲主產(chǎn)于貴州、山東、山西及東北各省[27]，地域分布不同，藥材受到土壤、溫度、光照、空氣、水分等外在因素的影響不同，從而產(chǎn)生不同品質(zhì)的藥材，多品種來源的藥材在質(zhì)量檢驗(yàn)中也會(huì)顯示出差異；采收時(shí)間，蒲黃為花粉入藥，采收時(shí)間不同會(huì)嚴(yán)重影響藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量，過早采收花粉產(chǎn)量低，過遲采收花粉自然脫落，產(chǎn)量和質(zhì)量均不佳；植物內(nèi)生菌和土壤微生物，植物內(nèi)生菌可影響宿主植物次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)和物質(zhì)代謝，土壤微生物可提高土壤肥力和改善土壤結(jié)構(gòu)，從而為藥材提供良好的生長條件。目前蒲黃并無道地藥材，因其使用廣泛，其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也更需進(jìn)一步完善，如嚴(yán)格把握藥材產(chǎn)地來源、采收時(shí)間、保證藥材規(guī)范化和規(guī)?；N植，探索蒲黃藥材的道地產(chǎn)區(qū)，提高蒲黃藥材的栽培技術(shù)，甚至創(chuàng)造蒲黃藥材特定的生長條件等，為更好地保障臨床合理、規(guī)范和有效使用蒲黃藥材奠定基礎(chǔ)。