張穎　王萍1　李二娜　田曉春　陳鵬

摘? ? 要：利用20對SSR引物分析48份籽用美洲南瓜種質(zhì)的遺傳多樣性并建立指紋圖譜，為籽用美洲南瓜種質(zhì)的親本選配、保護(hù)和鑒定提供依據(jù)。結(jié)果顯示，這20對引物在48份籽用美洲南瓜種質(zhì)中擴(kuò)增出115條具有多態(tài)性的等位基因，位點(diǎn)的Shannon信息指數(shù)（I）均值為1.36、遺傳多樣性指數(shù)（H）均值為0.69、多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）均值為0.63。聚類分析顯示，20對SSR引物可將48份種質(zhì)從0.659相似系數(shù)水平上分成兩大類。其中，第Ⅰ類包含46份種質(zhì)，在遺傳相似系數(shù)為0.679處又將其分為3個亞類。第一亞類包含來自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市的15份種質(zhì)和來自甘肅的18份種質(zhì)，第二亞類包含來自新疆的10份種質(zhì)，第三亞類包含來自山西的3份種質(zhì)。第Ⅱ類包含了來自內(nèi)蒙古呼倫貝爾市的2份種質(zhì)。綜合各項(xiàng)指標(biāo)篩選出5對SSR核心引物將48份籽用美洲南瓜種質(zhì)完全區(qū)分并構(gòu)建了指紋圖譜。

關(guān)鍵詞：籽用美洲南瓜;SSR標(biāo)記;指紋圖譜;遺傳多樣性

中圖分類號：S642.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2022）06-009-07

Genetic diversity analysis and SSR fingerprinting of seed-use pumpkin（Cucurbita pepo L.）germplasm

ZHANG Ying WANG Ping LI Erna TIAN Xiaochun CHEN Peng

（1. College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010000， Inner Mongolia， China; 2. Agricultural Reclamation Economic Development Office of Inner Mongolia Agricultural and Animal Husbandry Technology Extension Center， Hohhot 010000， Inner Mongolia， China）

Abstract：Twenty pairs of SSR polymorphic primers with good polymorphism and clear bands were used to analyze genetic diversity of 48 seed-use pumpkin （Cucurbita pepo L.） germplasm by fingerprinting for the purpose of parent selection， protection and identification. 115 polymorphic bands were amplified from the 48 pumpkin germplasm. The average Shannon’s information index （I） was 1.36， the average genetic diversity index （H） was 0.69， the average polymorphism information content （PIC） was 0.63. Cluster analysis showed that 48 accessions could be divided into two categories from the level of 0.659 similarity coefficient. The first category includes 46 accessions under three subclasses at the genetic similarity coefficient of 0.679. The first subclass has 15 accessions from Bayannur City， Inner Mongolia and 18 accessions from Gansu， the second subclass has 10 accessions from Xinjiang and the third subclass has 3 germplasms from Shanxi. The second category includes two accessions from Hulunbuir， Inner Mongolia. Five pairs of core SSR primers were selected based on diversity indexes. Forty-eight pumpkin germplasm were completely distinguished using fingerprinting based on the five core SSR primer pairs.

Key words：Cucurbita pepo L.; SSR markers; Fingerprints; Genetic diversity

籽用美洲南瓜俗稱籽用西葫蘆（Cucurbita pepo L.），為葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita L.）草本植物，以種子作為主要食用器官。我國籽用美洲南瓜的生產(chǎn)主要集中在黑龍江、新疆和內(nèi)蒙古三大產(chǎn)區(qū)，且出口量大，籽用美洲南瓜已成為重要的經(jīng)濟(jì)作物和深具特色的出口創(chuàng)匯型作物[1-3]。目前生產(chǎn)上優(yōu)良籽用美洲南瓜種質(zhì)資源較少，且重復(fù)使用少數(shù)種質(zhì)資源作為親本進(jìn)行雜交育種，導(dǎo)致栽培種的遺傳背景較窄，且大多數(shù)栽培種的病害抵抗力較差，嚴(yán)重限制了籽用美洲南瓜種育種材料的創(chuàng)新與利用[4-6]。此外，作物育種發(fā)展不充分不平衡問題，使得有限的研究成果難以在育種上得到充分應(yīng)用，在優(yōu)良品種選育方面的貢獻(xiàn)率沒有達(dá)到預(yù)期[7-8]。

伴隨現(xiàn)代分子遺傳育種技術(shù)的飛速發(fā)展，在基因水平上指導(dǎo)南瓜品種的改良、選育，是開展籽用美洲南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、加快育種進(jìn)程的重要步驟[9]。其中SSR（simple sequence repeat）分子標(biāo)記技術(shù)因具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、等位變異頻率高等優(yōu)點(diǎn)，在植物的遺傳多樣性分析中得到了廣泛應(yīng)用[10-11]。迄今為止，已有很多學(xué)者通過應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對南瓜屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析，王艷玲等[12]對南瓜屬的3個主要栽培種（中國南瓜、美洲南瓜、印度南瓜）的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明中國南瓜與美洲南瓜親緣關(guān)系較為相近，而印度南瓜則單獨(dú)在另一分支上，劉超[13]對76份籽用南瓜（籽用印度南瓜和籽用美洲南瓜）種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行研究，認(rèn)為籽用南瓜的親緣關(guān)系受其生態(tài)型及其來源地影響較大。全面系統(tǒng)地構(gòu)建指紋圖譜是快速厘清籽用美洲南瓜種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系、提升親本選配效率的重要舉措[14-15]。目前，利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，對玉米、大豆、小麥、水稻等[16-19]主要農(nóng)作物指紋圖譜的研究較多，而籽用美洲南瓜在這方面的報(bào)道則很少見。筆者應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對其48份種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行分析，并建立指紋圖譜，以期為籽用美洲南瓜種質(zhì)資源的保護(hù)和創(chuàng)新利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用48份籽用美洲南瓜種質(zhì)材料由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院籽用瓜課題組提供，均為通過多年多代自交選擇獲得的純系材料，其主要農(nóng)藝性狀如表1所示。于2021年5月23日采用隨機(jī)區(qū)組方式播種于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，每個小區(qū)20株，3次重復(fù)。同年8月采集生長旺盛期的植物嫩葉，用液氮急凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取及引物合成

48份供試材料的基因組DNA用試劑盒（天根生化有限公司）進(jìn)行提取，提取的DNA樣本通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量濃度，將DNA樣本質(zhì)量濃度稀釋至30～50 ng·μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。SSR標(biāo)記共用引物50對，其序列從相關(guān)文獻(xiàn)[20]中獲得。所有引物均由上海生物工程技術(shù)公司合成。

1.3 引物篩選及PCR反應(yīng)

以5份表型差異較為明顯的種質(zhì)材料對50對引物進(jìn)行初篩，初篩后選擇條帶清晰、多態(tài)性好的22對引物用于48份種質(zhì)的遺傳多樣性分析。PCR反應(yīng)體系為10 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物共1 μL，Taq Mix 5 μL，ddHO 2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)熱變性3 min;94 ℃變性20 s，68 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，6個循環(huán)（退火溫度每個循環(huán)降2 ℃）;94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，8個循環(huán)（退火溫度每個循環(huán)降1 ℃）;94 ℃變性20 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1.4 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并通過硝酸銀染色檢測種質(zhì)間的多態(tài)性。具體方法如下：30%丙烯酰胺21 mL，5×TBE buffer 14 mL，加蒸餾水定容至70 mL后加入10%的過硫酸銨700 μL溶液，配置70 mL的8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，最后在使用前加入50 μL的TEMED。待膠凝固后，將其與電泳槽組裝好，上下倒入1×TBE。在10 μL的PCR產(chǎn)物中加入2 μL的6×Loading Dye，混合均勻后進(jìn)行點(diǎn)樣，每孔1 μL。點(diǎn)樣后接通電源，在175 V的電壓下電泳120 min左右，銀染后拍照記錄。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對擴(kuò)增片段大小在250 bp以下的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用“1”和“0”兩種數(shù)字來表示條帶的分布情況，有條帶的位置用“1”表示，沒有條帶的位置用“0”表示，以此來獲得基礎(chǔ)的0/1矩陣。通過POWERMARKER 3.0分析引物多態(tài)性信息含量（PIC），使用軟件NTSYSPC2.10e對樣品進(jìn)行聚類分析，利用POPGEN32分析觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon信息指數(shù)（I）、遺傳多樣性指數(shù)（H）、期望雜合度（He）和觀測雜合度（Ho）。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物多態(tài)性分析

從50對引物中篩選出了多態(tài)性好、條帶清晰明亮的20對引物對48份種質(zhì)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，部分引物擴(kuò)增效果如圖1所示。20對引物共擴(kuò)增出122條清晰可統(tǒng)計(jì)的條帶，其中有115條多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為94.26%。由表2可知，在本研究的20對引物中，引物CMTp141的PIC值最高，為0.90;引物CMTp18的PIC值最低，為0.44。所有引物的PIC值均介于0.44～0.90之間，平均多態(tài)性信息含量為0.63。20對引物的Na值在3～13之間，平均為5.65。Ne值在2.05～10.32之間，平均為3.58。由此可見20對引物間的觀測等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)有較大差異，說明等位基因在群體內(nèi)存在分布不均的現(xiàn)象。20對引物的Ho值介于0.09～0.50之間，平均值為0.31。而He值介于0.52～0.91之間，平均為0.69，平均觀測雜合度小于平均期望雜合度。20對引物的I值在0.88～2.45之間，均值為1.36。其H值在0.51～0.90之間，均值為0.69。綜合以上各個指標(biāo)，表明試驗(yàn)所用的48份種質(zhì)材料具有較為豐富的遺傳多樣性。

2.2 籽用美洲南瓜種質(zhì)遺傳多樣性分析

根據(jù)這48份種質(zhì)的來源地將其分為5個群體，群體A包含來自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市的15份種質(zhì);群體B包含來自甘肅的18份種質(zhì);群體C包含來自新疆的10份種質(zhì);群體D包含來自山西的3份種質(zhì);群體E包含來自內(nèi)蒙古呼倫貝爾市的2份種質(zhì)。通過NTSYSPC2.10e軟件對48份材料進(jìn)行UPGMA聚類分析，其遺傳相似系數(shù)介于0.31～0.98之間。由圖2可知，48份種質(zhì)中親緣關(guān)系最近的是47和48，遺傳相似系數(shù)為0.98。而親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是6和18，遺傳相似系數(shù)為0.31。在遺傳相似系數(shù)為0.66水平處，可把這48份材料分成兩大類。第Ⅰ類包含了46份種質(zhì)，在遺傳相似系數(shù)為0.68的水平上又分為3個亞類。第一亞類包含1、2、12等15份種質(zhì)（屬群體A）和3、28、25等18份種質(zhì)（屬群體B），第二亞類包含31、19、24等10份種質(zhì)（屬群體C），第三亞類包含33、35、37共3份種質(zhì)（屬群體D）。第Ⅱ類包含了17、18兩份材料（屬群體E）。

2.3 不同籽用美洲南瓜種質(zhì)資源群體的遺傳多樣性分析

為進(jìn)一步分析籽用美洲南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性與其地域來源的關(guān)系以及不同區(qū)域籽用美洲南瓜種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，對這5個群體的I值進(jìn)行計(jì)算。由表3可知，5個群體的I值變化范圍為0.68～1.30，綜合各群體多樣性指數(shù)（Na、Ne、I）的計(jì)算結(jié)果，5個群體的遺傳多樣性由低到高依次為群體E<群體D<群體A群<群體C<群體B，由此可見群體E遺傳多樣性相對較匱乏，群體B的遺傳多樣性相對較為豐富。

2.4 不同籽用美洲南瓜群體間的遺傳一致度和遺傳距離分析

由表4可知，依據(jù)5個群體的遺傳距離（GD），其親緣關(guān)系由遠(yuǎn)到近進(jìn)行排序：群體E與群體D（0.46）>群體E與群體A（0.37）>群體E與群體C（0.30）>群體D與群體B（0.27）>群體D與群體A（0.26）>群體D與群體C（0.25）=群體E與群體B（0.25）>群體A與群體C（0.18）>群體C與群體B（0.16）>群體A與群體B（0.11）。這表明群體E與群體D的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，它們之間的遺傳一致度（GI）為0.63，遺傳距離（GD）為0.46;群體A與群體B的種質(zhì)的親緣關(guān)系最近，它們之間的GI為0.90，GD為0.11。

2.5 指紋圖譜的構(gòu)建

綜合多態(tài)性信息含量和基因頻率的數(shù)值，再結(jié)合基因型數(shù)據(jù)，挑選出5對引物。由表5可知，將這5對引物按照CMTp141、CMTp26、CMTp120、CMTp265、CMTp41的順序結(jié)合可將48份種質(zhì)材料完全區(qū)分開。利用材料在這5對引物中擴(kuò)增出的譜帶信息構(gòu)成“0/1”代碼，使得每份種質(zhì)材料都得到一個獨(dú)一無二的編碼，從而構(gòu)成了這48份材料的數(shù)字指紋圖譜，結(jié)合片段大小將它們繪制成圖3所示的指紋圖譜。

3 討論與結(jié)論

通過對引物的遺傳多樣性分析，結(jié)果表明本試驗(yàn)選用20對引物，擴(kuò)增出122條條帶，其中，多態(tài)性條帶115條，多態(tài)率94.26%，高于王洋洋[21]報(bào)道的同為SSR分子標(biāo)記多態(tài)性92.36%和劉超[13]報(bào)道的SSR分子標(biāo)記多態(tài)性85.89%，說明本試驗(yàn)所選用的引物具有較高的分辨率，能夠區(qū)分親緣關(guān)系較近的品種。研究中48份種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)變幅為0.31～0.98，說明這48份籽用美洲南瓜種質(zhì)間存在較豐富的遺傳多樣性。在聚類分析圖中遺傳相似系數(shù)為0.66處，可以將48份種質(zhì)分為兩大類，第一類包含了來自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市、甘肅、山西及新疆的所有種質(zhì)材料，而來自內(nèi)蒙古呼倫貝爾市的種質(zhì)材料則被單獨(dú)聚為一類，由此可見，呼倫貝爾市的種質(zhì)材料與其他4個地區(qū)的種質(zhì)材料的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。這與對這5個群體間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)的分析結(jié)果相一致。結(jié)合地理位置來看，呼倫貝爾種質(zhì)被單獨(dú)聚為一類可能是由于內(nèi)蒙古巴彥淖爾市、新疆、山西及甘肅都屬于中國的西北部，而內(nèi)蒙古呼倫貝爾市更靠近中國的東北部，且相近地區(qū)的籽用美洲南瓜種質(zhì)資源間存在頻繁交流，因此，地理位置相近種質(zhì)間的親緣關(guān)系較為密切。由此可見，種質(zhì)間的差異受其所處地理位置的影響較大，這與前人的結(jié)論較為一致[13，22]。

筆者采用引物組合法對供試材料進(jìn)行了區(qū)分，陳世軍等[23]曾用這種方法為60份黔南野生茶樹構(gòu)建了指紋圖譜。由于不同引物鑒別能力存在差異，PIC值最高的引物CMTp141僅能區(qū)分28個樣品，因此，按照PIC值最高的前4個引物對44份種質(zhì)資源進(jìn)行了區(qū)分。由于6和7、9和11之間的遺傳相似系數(shù)較高，僅有極個別引物能夠?qū)⑵鋮^(qū)分，因此，在符合要求的引物中選取PIC值最高的引物CMTp41對其進(jìn)行區(qū)分。但試驗(yàn)篩選出的引物的鑒別能力低于陶愛芬等[24]利用88份南瓜種質(zhì)（包含美洲南瓜、中國南瓜、印度南瓜）分析篩選出的可區(qū)分72份種質(zhì)的引物E5EM8。分析原因，可能是試驗(yàn)所用材料生態(tài)類型較為單一，親緣關(guān)系較近，難以通過較少的引物組合對大量種質(zhì)進(jìn)行完全區(qū)分。后續(xù)為了獲取區(qū)分能力強(qiáng)的引物，可選擇地理來源更加廣泛、生態(tài)類型更加豐富的材料進(jìn)行試驗(yàn)。本試驗(yàn)雖利用5對核心引物將48份種質(zhì)完全區(qū)分，但隨著籽用美洲南瓜的種質(zhì)資源越來越豐富，這5對引物的鑒別能力也會逐漸下降，需要繼續(xù)對來自不同地區(qū)籽用美洲南瓜的種質(zhì)進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建，篩選出更多鑒別能力強(qiáng)的引物，進(jìn)一步完善籽用美洲南瓜種質(zhì)的指紋圖譜。

利用篩選出的20對多態(tài)性引物對48份種質(zhì)進(jìn)行多樣性分析，試驗(yàn)篩選出的20對多態(tài)性較高的引物（PIC≥0.4），可為后續(xù)研究提供可參考的引物材料;基于SSR分子標(biāo)記進(jìn)行聚類，48份種質(zhì)被聚為5類，聚類結(jié)果與地理來源相一致，即同一地區(qū)種質(zhì)被聚為一類，說明個體間親緣關(guān)系與地理來源密切相關(guān)，與群體間遺傳距離分析結(jié)果一致性較高;本試驗(yàn)將5對核心引物（CMTp141、CMTp26、CMTp120、CMTp256、CMTp41）進(jìn)行組合，將48份種質(zhì)完全區(qū)分，進(jìn)一步完善了籽用美洲南瓜種質(zhì)的指紋圖譜。

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