韓卓濤，陳育林，文小波，盧悅

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039）

全球每年大約生產(chǎn)3500萬t塑料垃圾，其中大約只有7%經(jīng)回收處理，剩余大部分被堆積于垃圾填埋場自然降解[1]。傳統(tǒng)塑料降解緩慢，且在降解過程中會(huì)產(chǎn)生微塑料，不僅影響環(huán)境，更會(huì)危害人類健康[2]。這些問題推動(dòng)了對可降解的、安全的傳統(tǒng)塑料替代品的需求。聚羥基丁酸酯（Polyhydroxybutyrate,PHB）是最早發(fā)現(xiàn)的聚羥基脂肪酸酯，由于具有可生物降解性、可再生性、生物相容性和環(huán)境友好性等優(yōu)點(diǎn)，可作為傳統(tǒng)塑料的潛在替代品[3]。

PHB主要依賴于微生物發(fā)酵生產(chǎn)，可由許多細(xì)菌和古細(xì)菌在氮或磷受限時(shí)，作為碳源和能量物質(zhì)被合成并積累于細(xì)胞內(nèi)，由于較高的原料成本限制了其大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用，因此目前PHB主要用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4?5]。甘蔗糖蜜是制糖工業(yè)的主要副產(chǎn)物，含有豐富的多糖和還原糖，每生產(chǎn)1 t原糖便會(huì)有0.38 t糖蜜產(chǎn)出[6]。中國作為世界上最大的糖產(chǎn)區(qū)之一，糖蜜的年生產(chǎn)量可達(dá)400萬t[7]。李曼瑋[8]通過對甘蔗糖蜜的預(yù)處理，使其轉(zhuǎn)化為易于利用的碳源，比如葡萄糖、果糖等，供微生物用于PHB的生產(chǎn)。除可發(fā)酵單糖外，乙酰丙酸（Levulinic acid,LA）也可用于培養(yǎng)殺蟲貪銅菌（Cupriavidus necator,C.necator），并制備PHB[9?10]。作為具有較高應(yīng)用價(jià)值綠色平臺(tái)化合物的LA，可由多種廢棄生物質(zhì)經(jīng)酸水解產(chǎn)生，是一種廉價(jià)、易得的發(fā)酵原料[11]。通常，含糖生物質(zhì)為原料制備LA采用稀H2SO4和稀HCl的均相催化處理水解[12]。在此過程中，LA產(chǎn)率往往受多個(gè)條件因素的影響，對于多變量問題，采用響應(yīng)面法可以簡單準(zhǔn)確地找出最優(yōu)的一組水解條件因素[13]。

本試驗(yàn)以甘蔗糖蜜為原料，以H2SO4為催化劑，在單因素的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法對LA的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得更高的LA產(chǎn)率。同時(shí)利用甘蔗糖蜜水解液培養(yǎng)C.necator生產(chǎn)PHB，以期為后續(xù)研究提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 試劑

市售糖蜜；LA，分析純，上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司；濃硫酸、甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、5-羥甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural,5-HMF）、糠醛、氯仿，分析純，甲醇，色譜純，成都科隆化學(xué)品有限公司；PHB，上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPM液體培養(yǎng)基、礦物質(zhì)溶液培養(yǎng)基按照Mohan等[1]試驗(yàn)方法進(jìn)行配制，甘蔗糖蜜水解液培養(yǎng)基：在礦物質(zhì)溶液培養(yǎng)基中添加甘蔗糖蜜水解液使培養(yǎng)基中LA初始濃度為5 g/L。甘蔗糖蜜水解液在響應(yīng)面法獲得的最佳條件下制得，經(jīng)8000 r/min離心5 min去除雜質(zhì)。上述培養(yǎng)基使用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0后121℃下滅菌20 min。

1.1.3 菌株

殺蟲貪銅菌（CGMCC 1.7093），購于中國普通微生物菌種管理保藏中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘蔗糖蜜酸水解制備LA的單因素試驗(yàn)

選擇液固比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察其對LA產(chǎn)率的影響。各因素的梯度設(shè)置：液固比為1、2、3、4、5 mL/g；反應(yīng)溫度為60、100、140、180、220℃；反應(yīng)時(shí)間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件，以LA產(chǎn)率（%）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定甘蔗糖蜜酸水解制備LA的最佳條件。響應(yīng)面因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平

1.2.3 甘蔗糖蜜酸水解處理

取一定量的甘蔗糖蜜和0.67 mol/L的H2SO4溶液[14]于反應(yīng)釜中充分混勻，將反應(yīng)釜放入強(qiáng)對流烘箱（Memmert UF260）中加熱，在不同溫度下反應(yīng)到預(yù)定時(shí)間后迅速水冷至室溫。將產(chǎn)物過濾獲得水解液和殘?jiān)?。水解液?jīng)稀釋適當(dāng)倍數(shù)后通過高效液相色譜法（HPLC，島津LC16，配備SPD-16紫外可見雙波長檢測器）測定其中LA含量，并計(jì)算LA產(chǎn)率。

1.2.4 LA含量測定和產(chǎn)率計(jì)算

參考陳小敏等[15]的試驗(yàn)方法測定水解液中LA含量，LA產(chǎn)率（%）按照公式（1）來計(jì)算。

式中：ρ1為通過HPLC測得的LA濃度；N為稀釋倍數(shù)；V為水解液體積；M為糖蜜質(zhì)量。

1.2.5 水解液中小分子酸、5-HMF和糠醛含量測定

參照盧倩文等[16?17]的試驗(yàn)方法分別測定水解液中的甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、5-HMF和糠醛的含量。

1.2.6 甘蔗糖蜜水解液培養(yǎng)C.necator產(chǎn)PHB試驗(yàn)

在YPM固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落接種于裝有YPM液體培養(yǎng)基試管中，于30℃150 r/min培養(yǎng)24 h。8000 r/min離心5 min收集菌體，棄去發(fā)酵上清液，用0.85%的NaCl溶液復(fù)懸，按照5%接種量接種于糖蜜水解液培養(yǎng)基中，250 mL錐形瓶裝樣量100 mL，于30℃150 r/min培養(yǎng)48 h。通過干重法測得生物量。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)收集菌體烘干后測定PHB含量。

1.2.7C.necator菌體中PHB含量測定

參照Lu等[18]試驗(yàn)方法進(jìn)行菌體中PHB的提取和測定，按照公式（2）計(jì)算菌體中PHB含量（%）。

式中：m為測得的PHB質(zhì)量；M2為菌體質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，采用IBM SPSS statistics 20軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，采用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖，采用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對LA產(chǎn)率的影響

以蔗糖為主要成分的糖蜜酸水解制備LA一般需要經(jīng)歷3個(gè)過程[19]，如圖1所示，在高溫高壓酸性條件下，蔗糖首先水解生成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖進(jìn)一步脫水形成5-HMF，5-HMF經(jīng)水合反應(yīng)最終形成LA和甲酸。在反應(yīng)過程中，溫度的升高和壓力的增大會(huì)提高單糖生成5-HMF以及5-HMF生成LA的反應(yīng)速率，但過高的溫度會(huì)使單糖和5-HMF發(fā)生碎裂反應(yīng)生成更多的副產(chǎn)物[20]。反應(yīng)體系中原料的占比和水解時(shí)間也影響著反應(yīng)的進(jìn)程，因此以甘蔗糖蜜作為LA生產(chǎn)原料時(shí)，有必要研究液固比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對LA產(chǎn)率的影響。

圖1 蔗糖酸催化轉(zhuǎn)化為LA的反應(yīng)路線

液固比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對LA產(chǎn)率影響如圖2所示。由圖2（a）可知，隨著反應(yīng)體系中糖蜜含量的降低，LA產(chǎn)率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)液固比為2 mL/g時(shí)，LA產(chǎn)率最高，為34.05%。當(dāng)反應(yīng)體系中糖蜜含量較低時(shí)，H2SO4不能與糖蜜更好地接觸，水解效率降低，但糖蜜含量過高時(shí)會(huì)破壞反應(yīng)體系的均勻性，溶液呈粘稠狀，水解過程中糖蜜易碳化從而使得LA產(chǎn)率下降[21]；因此，選擇液固比為2 mL/g左右較為適宜。

反應(yīng)溫度對LA產(chǎn)率的影響如圖2（b）所示，在140℃時(shí)LA產(chǎn)率最高，為36.45%。隨著反應(yīng)溫度的提高，LA產(chǎn)率下降，在220℃降低至21.31%。氫離子電離速度會(huì)隨著溫度的升高而加快，從而提高水解速度，但高溫會(huì)促使糖蜜生成更多的焦炭物質(zhì)[19]，從而降低LA產(chǎn)率，同時(shí)高溫也會(huì)加重H2SO4對容器的腐蝕程度[22?23]；因此，水解溫度選擇140℃左右為宜。

圖2 液固比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對LA產(chǎn)率的影響

反應(yīng)時(shí)間對LA產(chǎn)率的影響如圖2（c）所示，反應(yīng)的前1.5 h內(nèi)LA產(chǎn)率明顯提高并在1.5 h達(dá)到最大，為39.77%。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)一步延長，LA產(chǎn)率下降并維持在一定水平，因此反應(yīng)時(shí)間選擇為1.5 h左右。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果與驗(yàn)證

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以液固比（A）、反應(yīng)溫度（B）和反應(yīng)時(shí)間（C）作為自變量，以液固比2 mL/g，反應(yīng)溫度140℃，反應(yīng)時(shí)間1.5 h為響應(yīng)面分析中心點(diǎn)，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（表2）。17次試驗(yàn)表明，液固比越小、反應(yīng)時(shí)間越短，LA產(chǎn)率越高，最高可達(dá)到46.27%，相反，高液固比和較長反應(yīng)時(shí)間導(dǎo)致LA產(chǎn)率最高僅為24.91%。高溫和低溫對LA的產(chǎn)率均有負(fù)面影響，100℃下LA最高產(chǎn)率僅為25.15%，180℃下LA最高產(chǎn)率為35.03%。采用Design-Expert 8.0.6軟件對表中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析建立二次響應(yīng)回歸方程，擬合得到LA響應(yīng)回歸方程：

表2 甘蔗糖蜜酸水解制備LA Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對模型進(jìn)行顯著性和方差分析，由表3可知回歸方程決定系數(shù)R2=0.9026，R2Adj=0.7774，F(xiàn)值為7.21，回歸模型P＜0.01，達(dá)到極顯著水平，說明該方程顯著回歸，這意味著液固比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的聯(lián)合效應(yīng)對LA產(chǎn)率的變化有顯著影響。模型失擬項(xiàng)P>0.05，差異不顯著，表明模型擬合程度良好且試驗(yàn)誤差較小，可以用于分析和檢測。各因素交互作用響應(yīng)曲面圖如圖3所示。圖3（a）表明，當(dāng)溫度為140℃時(shí)，LA產(chǎn)率達(dá)到最大，這意味著溫度進(jìn)一步提高到140℃以上時(shí)不會(huì)導(dǎo)致LA產(chǎn)率按比例增加。圖3（b）曲面最陡，說明液固比和反應(yīng)時(shí)間的交互作用對LA產(chǎn)率的影響最為顯著。圖3（b）和圖3（c）相應(yīng)曲線上沒有顯示出最大點(diǎn)和最小點(diǎn)，但該設(shè)計(jì)的范圍已經(jīng)可以為分析提供足夠的有效信息，另一方面，不需要在更高液固比和更高反應(yīng)時(shí)間下試驗(yàn)，因?yàn)長A產(chǎn)率極低。

圖3 各因素相互作用對LA產(chǎn)率響應(yīng)值的響應(yīng)面圖

表3 甘蔗糖蜜酸水解制備LA響應(yīng)面設(shè)計(jì)回歸模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證

根據(jù)以上優(yōu)化結(jié)果，對模型預(yù)測值進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)實(shí)際情況將預(yù)測條件優(yōu)化為：液固比1.24 mL/g、反應(yīng)溫度為146℃、反應(yīng)時(shí)間為1 h，此條件下LA的產(chǎn)率為44.09%，與預(yù)測值（43.26%）接近，表明優(yōu)化模型合理可靠。未優(yōu)化時(shí)LA產(chǎn)率為17.39%，優(yōu)化后LA產(chǎn)率大大提高。此外，本次優(yōu)化后LA的產(chǎn)率優(yōu)于宋道君等[21]報(bào)道使用硫酸催化甘蔗糖蜜制備LA的產(chǎn)率（30.11%）。

2.3 水解液成分的種類和含量

已有研究表明，過高濃度的小分子酸會(huì)對C.necator產(chǎn)生較強(qiáng)的生理毒性，抑制細(xì)胞生長，因此在發(fā)酵過程中應(yīng)維持LA≤5 g/L、甲酸≤2 g/L、乙酸≤1 g/L、丙酸和丁酸≤0.5 g/L[9,24]。呋喃類化合物5-HMF和糠醛會(huì)導(dǎo)致C.necator的延滯期延長，但其在發(fā)酵液中濃度小于5 mmol/L時(shí)，C.necator可以通過自身的代謝機(jī)制對其進(jìn)行有效脫毒[1]。對水解液中含有的幾種小分子酸、5-HMF和糠醛含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明（表4），LA濃度可達(dá)196.20±3.32 g/L，甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸和5-HMF的濃度分別為46.23±4.16、37.84±3.47、24.86±2.06、2.02±0.06和25.11±0.57 g/L，糠醛的濃度較低，僅有0.43±0.06 g/L。水解液中LA等成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于C.necator的耐受范圍，進(jìn)行批次發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)，對水解液應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)稀釋以降低其對C.necator的抑制作用。

表4 糖蜜水解液成分的種類和含量

2.4 糖蜜水解液培養(yǎng)C.necator

本研究通過富含LA的甘蔗糖蜜水解液培養(yǎng)C.necator驗(yàn)證其生產(chǎn)PHB的可行性。C.necator利用LA合成PHB的代謝網(wǎng)絡(luò)見圖4。LA以自由擴(kuò)散的形式進(jìn)入C.necator細(xì)胞后被?；o酶A合成酶激活生成丙酰輔酶A和乙酰輔酶A[25?26]，其中丙酰輔酶A可以通過2-甲基檸檬酸循環(huán)生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A可進(jìn)入三羧酸循環(huán)用于細(xì)胞生長。兩分子乙酰輔酶A在β-酮硫酶作用下縮合生成乙酰乙酰輔酶A，后者在NADPH依賴性乙酰乙酰輔酶A還原酶的作用下生成3-羥基丁酸?；o酶A，最后在PHA聚合酶的作用下縮合形成不斷延長的聚合物骨架[25?28]。

圖4 C.necator利用LA合成PHB的代謝網(wǎng)絡(luò)

和其他小分子酸類似，LA可以酸化細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)并抑制血紅素合成從而影響細(xì)菌的新陳代謝，雖然可以通過逐步提高培養(yǎng)基中LA的濃度來增強(qiáng)C.necator對其耐受程度，但野生型C.necator只能在最高5 g/L LA下正常生長[9]。為了避免高濃度LA對C.necator產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用以及低濃度LA下碳源供應(yīng)不足的情況，配制LA濃度為5 g/L的糖蜜水解液培養(yǎng)基培養(yǎng)C.necator進(jìn)行PHB的生產(chǎn)試驗(yàn)。試驗(yàn)表明（圖5），前12 hC.necator處于對LA的適應(yīng)階段，生長緩慢，可能5 g/L LA仍然會(huì)對其產(chǎn)生一定的生理毒性。隨著LA濃度的降低以及生物量的緩慢增長，C.necator對LA的耐受能力提高并在12～36 h期間快速生長。36 h以后由于LA濃度較低，C.necator可利用的碳源不足，生長減緩。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)量計(jì)算公式C4.08H6.87N1.0O1.89可以推測氮約占C.necator細(xì)胞質(zhì)量的14%[18]。本研究以2 g/L (NH4)2SO4作為細(xì)胞生長的唯一氮源，因此可以預(yù)測當(dāng)?shù)赐耆暮笈囵B(yǎng)基中會(huì)形成約3 g/L生物量。培養(yǎng)48 h生物量達(dá)到2.99 g/L，與預(yù)測值接近，因此推測此時(shí)發(fā)酵液中僅殘留少量未被利用的(NH4)2SO4。當(dāng)碳源充足的培養(yǎng)基中存在氮時(shí)，C.necator主要進(jìn)行菌體生長，在氮匱乏時(shí)C.necator才會(huì)在細(xì)胞內(nèi)合成大量PHB[29?30]。經(jīng)測定，培養(yǎng)48 h菌體中PHB含量占細(xì)胞干重的14.85%，發(fā)酵后期碳源的不足可能導(dǎo)致最終菌體中PHB含量較低，但通過本次試驗(yàn)足以說明富含LA的糖蜜水解液可以用于PHB的生產(chǎn)。

圖5 糖蜜水解液中C.necator生長和LA消耗曲線

3 結(jié)論

本文以糖蜜為原料酸水解制備LA，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，獲得最佳條件為液固比1.24 mL/g、反應(yīng)溫度146℃、反應(yīng)時(shí)間1 h，水解液中LA的質(zhì)量濃度為196.20±3.32 g/L，糖蜜轉(zhuǎn)化為LA的產(chǎn)率為44.09%。水解液的其他成分質(zhì)量濃度為：甲酸46.23±4.16 g/L、乙酸37.84±3.47 g/L、丙酸24.86±2.06 g/L、正丁酸2.02±0.06 g/L、5-HMF 25.11±0.57 g/L、糠醛0.43±0.06 g/L。以稀釋后的糖蜜酸水解液為原料，培養(yǎng)C.necator48 h后，生物量達(dá)到2.99 g/L，菌體中PHB含量占細(xì)胞干重的14.85%。本文建立的二次多項(xiàng)式模型回歸性顯著且擬合程度良好，通過本次優(yōu)化明顯提高了糖蜜酸水解制備LA的產(chǎn)率，并驗(yàn)證了利用富含LA的糖蜜水解液用于生產(chǎn)PHB的可行性，為降低PHB生產(chǎn)成本提供了新的思路。