楊萍，岳天義，張萍，馬嫄，許青蓮，劉洪，黃紅，邢亞閣*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 611743；2.宜賓西華大學(xué)研究院食品非熱技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川宜賓 644000；3.環(huán)太生物科技股份有限責(zé)任公司,四川成都 610200）

黑苦蕎是苦蕎中的一種，具有較高的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。黑苦蕎已被廣泛應(yīng)用于生物藥業(yè)、食品添加劑和化妝品等領(lǐng)域，具有良好的開(kāi)發(fā)前景[1?2]。隨著黑苦蕎的利用和開(kāi)發(fā)，黑苦蕎殼作為其加工副產(chǎn)物具有寬泛的實(shí)用價(jià)值[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苦蕎殼中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，其含量是苦蕎籽中黃酮類物質(zhì)的三倍多[4]，苦蕎殼中除黃酮類化合物外還有其他活性物質(zhì)，如多糖等也具有良好的生物活性[5]。此外，苦蕎殼還具有抗氧化、降血糖、抗癌、抗衰老、抗高血壓、降膽固醇等功效，這些效應(yīng)可能跟苦蕎殼中存在的某些生物活性成分密切相關(guān)，這些生物活性成分包括黃酮類物質(zhì)、酚酸、鞣荊、維生素、礦物質(zhì)、必需氨基酸和蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維[6?10]。但黑苦蕎殼含有潛在的過(guò)敏原，如蛋白質(zhì)抑制劑等，對(duì)人體健康有負(fù)面影響，經(jīng)過(guò)加工處理功能成分可以得到更好的釋放以及被人體更好吸收。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)黑苦蕎殼的研究主要集中于對(duì)黃酮的提取方式和營(yíng)養(yǎng)功能[11?13]等方面的研究，在加工方式及利用方面的研究還比較欠缺，尤其是各加工方式對(duì)黑苦蕎殼中功能性組分及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響方面的研究更少。烘焙作為一種熱加工方式可以起到食物熟化作用，可有效減少谷物中的抗?fàn)I養(yǎng)成分[14]。此外，烘焙已經(jīng)被用作一種傳統(tǒng)的加工方法，其干熱熟化作用可以提高黑苦蕎殼生物活性，促進(jìn)抗氧化成分的分解，與未加工產(chǎn)品相比具有更好的風(fēng)味、更長(zhǎng)的保質(zhì)期和脆度[15]。喬麗華等[16]研究發(fā)現(xiàn)烘焙對(duì)小粒黑豆的酚類物質(zhì)及抗氧化活性有顯著影響，200℃條件下烘焙后的總酚含量最高，150℃下最低。陸理民[17]對(duì)苦蕎進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)80℃，15 min烘烤后抗氧化活性達(dá)到最好，酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)與抗氧化能力呈相關(guān)性。

目前，對(duì)黑苦蕎殼烘烤工藝的研究鮮有報(bào)道。利用熱風(fēng)干燥對(duì)黑苦蕎殼進(jìn)行熱加工，一方面普通烘烤條件可以達(dá)到熱加工要求，實(shí)現(xiàn)物料受熱充分，另一方面，普通烘烤成本低，物料加工承載量大，可實(shí)現(xiàn)工廠大批量加工生產(chǎn)。因此，本研究以黑苦蕎殼為原料，采用響應(yīng)面法的Box-Behnken模式，以黑苦蕎殼中總黃酮及總酚含量為指標(biāo)，探究其最佳烘烤工藝，系統(tǒng)研究烘烤前后酚類物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)功能含量的差異，為黑苦蕎殼相關(guān)保健食品的開(kāi)發(fā)和研究提供最佳工藝方法，同時(shí)也為其他相關(guān)種屬植物的產(chǎn)品加工提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑苦蕎殼（川蕎2號(hào)），由環(huán)太生物科技股份有限公司提供；沒(méi)食子酸，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用主要儀器與設(shè)備見(jiàn)表1。

表1 主要儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 黑苦蕎殼酚類物質(zhì)提取

提取方法參照Sun等[18]方法，稍加修改。準(zhǔn)確稱取未烘烤及烘烤后的黑苦蕎殼粉1.000 g按料液比1∶20(mg/mL)與甲醇溶液充分混勻，超聲波提取30 min，4000 r/min離心10 min取上清液，每個(gè)樣品平行提取3次。合并上述3次提取液，于65℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用甲醇溶解并定容至20 mL，提取液于?18℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總黃酮含量測(cè)定方法

采用NaNO2-Al(NO3)3法[19]，稍作改動(dòng)。取200μL適當(dāng)稀釋液的黑苦蕎殼樣品提取液與等體積5% NaNO2混合避光反應(yīng)5 min，然后向上述反應(yīng)液加入200μL 10% Al(NO3)3溶液,反應(yīng)5 min，然后向上述反應(yīng)液加入2 mL 4%NaOH溶液，然后繼續(xù)加入2.4 mL蒸餾水混勻，繼續(xù)反應(yīng)15 min，于510 nm下測(cè)吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)曲，所得標(biāo)曲方程為Y1=0.1076X?0.0021，R2=0.9997；在0.01～0.16 mg/ mL 范圍有良好線性關(guān)系。

1.3.3 總酚含量測(cè)定方法

采用Folin-Ciocalteu法[20]，稍加修改。取1 mL樣品稀釋液與200μL福林酚試劑混合均勻，反應(yīng)6 min，然后加入7.5 mL 7% Na2CO3溶液，室溫下避光反應(yīng)90 min，最后于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，回歸方程：Y2=0.1736X+0.0584，R2=0.9982。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，由Box-Behnken軟件中的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)設(shè)計(jì)原理，選擇烘烤時(shí)間、烘烤溫度、鋪盤厚度進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，以各因素下主要活性成分總黃酮及總酚含量為指標(biāo)確定最佳烘烤條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.3.5 黑苦蕎殼營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)測(cè)定

黑苦蕎殼水分，GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》直接干燥法[21]；灰分，GB/T 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》灼燒法[22]；粗脂肪，GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》索氏抽提法[23]；粗蛋白，GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》自動(dòng)凱氏定氮儀法[24]。

1.3.6 HPLC 法測(cè)定黑苦蕎殼中酚類物質(zhì)組成及含量

參考孫坤坤等[2]和Gao[25]的研究，稱取沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、對(duì)香豆酸、槲皮素和山奈酚各10.0 mg制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，用色譜級(jí)甲醇稀釋溶解成1 mg/mL的母液，再逐級(jí)稀釋得到濃度為5、10、20、50、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾備用。測(cè)得沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、對(duì)香豆酸、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=44237x?56820、y=12618x?17110、y=12691x+36791、y=12288x?30747、y=15186x?35039、y=20809x?20301和y=25301x?54407。

黑苦蕎殼提取液經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜儀測(cè)定。

色譜柱條件：色譜柱為C18(4.6×250 mm)；流動(dòng)相條件為A相0.15%甲酸溶液，B相100%乙腈；流速為0.7 mL/min；進(jìn)樣量20μL；柱溫35°C；檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。梯度洗脫程序：0～5 min，B相10%;5～50 min，B相40%；50～60 min，B相10%。

1.3.7 掃描電鏡觀察

采用JSM-7500F場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(SEM)觀察黑苦蕎殼粉的形態(tài)。參考王藝靜[26]的方法，稍微修改，取適量樣品均勻分布于導(dǎo)電膠上，首先進(jìn)行噴金、處理，再放入電鏡載物臺(tái)上于15.00 kV操作電壓下觀察樣品的形態(tài)，選擇清晰典型顆粒拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0和OriginPro 8.5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理與作圖，并進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平P＜0.05，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑苦蕎殼烘烤條件響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果上，用Design-Expert 8.0軟件，以A（烘烤時(shí)間）、B（烘烤溫度）、C（鋪盤厚度）為因素，以黑苦蕎殼總黃酮含量和總酚含量為響應(yīng)變值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，整個(gè)試驗(yàn)共進(jìn)行17次，試驗(yàn)結(jié)果及方差分析如表3—表5所示，響應(yīng)曲面如圖1所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 總黃酮響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

表5 總酚響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

對(duì)該模型進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)及方差分析，其結(jié)果見(jiàn)表4所示。烘烤時(shí)間（min）、烘烤溫度（℃）影響顯著（P＜0.05）。在A、B、C項(xiàng)中，所有變量的二次效應(yīng)和交互效應(yīng)都在A、B、C之間。將總黃酮含量與烘烤因素的工藝變量相關(guān)聯(lián)的數(shù)學(xué)模式生成方程（1），以證明3個(gè)因素與響應(yīng)Y之間的關(guān)系?；貧w方程表明，烘烤時(shí)間和烘烤溫度對(duì)黑苦蕎殼總酚含量的影響較大，鋪盤厚度影響不顯著。烘烤時(shí)間和烘烤溫度、烘烤時(shí)間和鋪盤厚度、烘烤溫度和鋪盤厚度交互作用顯著。各因素間的交互作用對(duì)黑苦蕎殼中提取的總酚含量影響顯著，而鋪盤厚度對(duì)總酚含量的影響最小。由表4可知，模型的F值為59.70，P＜0.01，表明模型達(dá)到極顯著水平。失擬項(xiàng)的F值為0.18，P=0.9067>0.05，說(shuō)明差異不顯著，回歸模型準(zhǔn)確可靠。此外，該模型的決定系數(shù)R2=0.9871，而校準(zhǔn)決定系數(shù)R2Adj=0.9706，表明該模型可以解釋97.06%的響應(yīng)值變化，達(dá)到了較高的擬合度。因此，該模型可用于確定黑苦蕎殼烘烤最佳工藝條件。

對(duì)分析所得數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到3個(gè)因子與黑苦蕎殼中總黃酮含量之間的模擬回歸方程為

由表5響應(yīng)面方差分析結(jié)果可知，烘烤時(shí)間（min）、烘烤溫度（℃）極顯著（P＜0.01）。在A、B、C項(xiàng)中，所有變量的二次效應(yīng)和交互效應(yīng)都在A、B、C之間。將總酚含量與烘烤因素的工藝變量相關(guān)聯(lián)的數(shù)學(xué)模式生成方程（2），以證明三個(gè)因素與響應(yīng)Y之間的關(guān)系。回歸方程表明：烘烤時(shí)間和烘烤溫度對(duì)黑苦蕎殼總酚含量的影響較大；烘烤時(shí)間和烘烤溫度、烘烤時(shí)間和鋪盤厚度、烘烤溫度和鋪盤厚度交互作用顯著；各因素間的交互作用對(duì)黑苦蕎殼中提取的總酚含量影響顯著，而鋪盤厚度對(duì)總酚含量的影響最小。由表5可知，模型的F值為61.16，P＜0.01，表明模型達(dá)到極顯著水平。失擬項(xiàng)的F值為5.96，P=0.0587>0.05，說(shuō)明差異不顯著，回歸模型準(zhǔn)確可靠。此外，該模型的決定系數(shù)為R2=0.9874，而校準(zhǔn)決定系數(shù)為R2Adj=0.9713，表明該模型可以解釋97.13%的響應(yīng)值變化，達(dá)到了較高的擬合度。因此，該模型可用于確定黑苦蕎殼烘烤最佳工藝條件。

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以總酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)的二階多項(xiàng)方程為

2.2 黑苦蕎殼烘烤條件響應(yīng)面分析及優(yōu)化

烘烤條件對(duì)黑苦蕎殼總酚及總黃酮含量的影響及不同因素間的變化交互作用，其中A、B項(xiàng)以及二次項(xiàng)A2、B2的影響極顯著（P＜0.01），C2影響顯著（P＜0.05）。F值揭示了本實(shí)驗(yàn)中烘烤因素的貢獻(xiàn)：烘烤溫度>烘烤時(shí)間>鋪盤厚度。圖1（a）和圖1（d）顯示了烘烤時(shí)間和溫度對(duì)總黃酮和總酚含量的影響。當(dāng)烘烤時(shí)間較短時(shí)，總黃酮和總酚含量不隨烘烤條件發(fā)生顯著變化。當(dāng)烘烤時(shí)間為6.8 min時(shí)，隨著烘烤溫度的變化，總黃酮和總酚含量顯著增加。圖1（b）和圖1（e）顯示了烘烤時(shí)間鋪盤厚度之間的相互作用對(duì)總黃酮和總酚含量的影響。兩者之間的相互作用對(duì)總黃酮和總酚含量有顯著影響（P＜0.0001，P=0.0469）。當(dāng)烘烤時(shí)間為111.72 min時(shí)，鋪盤厚度為1.41 cm時(shí)總黃酮和總酚含量達(dá)到最大值。圖1（c）和圖1（f）顯示了烘烤溫度和鋪盤厚度相互作用對(duì)總黃酮和總酚含量的影響，兩者相互作用對(duì)總黃酮和總酚含量有顯著影響（P=0.0007，P=0.0086）。

圖1 各因素對(duì)總酚含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.3 黑苦蕎殼最佳烘烤工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)模型預(yù)測(cè)，最終以總黃酮為評(píng)價(jià)指標(biāo)得到各因素顯著程度依次為烘烤溫度（P＜0.0001）>烘烤時(shí)間（P=0.0378）>鋪盤厚度（P=0.1294）。利用響應(yīng)面法進(jìn)一步分析確定了苦蕎殼烘烤條件最佳工藝參數(shù)：烘烤時(shí)間11.72 min、烘烤溫度74.8℃和鋪盤厚度1.41 cm，考慮到實(shí)際情況調(diào)整為烘烤時(shí)間12 min、烘烤溫度75℃和鋪盤厚度1.4 cm。采用優(yōu)化后的烘烤工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，此條件下測(cè)得實(shí)際總黃酮含量為9.1 mg RE/g，總酚含量為38.9 mg GAE/g。由此可知，采用響應(yīng)面法對(duì)苦蕎殼烘烤條件工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化得出的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.4 烘烤對(duì)黑苦蕎殼基本營(yíng)養(yǎng)成分影響分析

將黑苦蕎殼于最佳工藝下進(jìn)行烘烤，對(duì)烘烤后的黑苦蕎殼和對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，測(cè)定對(duì)比兩組的水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白含量，結(jié)果如表6所示。此研究發(fā)現(xiàn)，在75℃下烘焙12 min會(huì)影響黑苦蕎殼灰分、粗脂肪含量，降低水分、粗蛋白含量，這與馬藝超[27]研究的不同熱加工對(duì)苦蕎麥制品進(jìn)行處理，其粗蛋白含量降這一結(jié)果相似。這可能是因?yàn)樵跓崽幚磉^(guò)程中，形成了美拉德化合物。由于賴氨酸的游離氨基之間的化學(xué)反應(yīng)還原糖的羰基，這些羰基主要來(lái)源于蛋白質(zhì)和淀粉的分解[28]。

表6 烘烤對(duì)黑苦蕎殼營(yíng)養(yǎng)成分的影響 %

2.5 黑苦蕎殼酚類物質(zhì)的成分分析

孫坤坤等[2]研究了不同低海拔地區(qū)的黑苦蕎中的酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)黑苦蕎中的主要酚酸為蘆丁、槲皮素、表兒茶素、山奈酚等物質(zhì)?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品HPLC 圖如圖2所示，根據(jù)圖譜確定黑苦蕎殼中單酚物質(zhì)的含量。

圖2 7種酚類化合物在黑苦蕎殼中的HPLC分析結(jié)果圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑苦蕎殼經(jīng)最佳工藝條件烘烤后酚類物質(zhì)含量發(fā)生變化，變化情況如表7所示。烘烤后沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、對(duì)香豆酸、山奈酚含量分別為含量為14.10 mg GAE/100g，0.758 mg GAE/100g、1.626 mg GAE/100g、0.772 mg GAE/100g、0.52 mg GAE/100g，這5種物質(zhì)含量與未烘烤組相比都有所增加。蘆丁和槲皮素含量分別為1.140 mg GAE/100g、11.96 mg GAE/100g，與未烘烤組相比相對(duì)減少了4.8%和28.0%。這可能是因?yàn)榻?jīng)烘烤黑苦蕎殼中的酚類物質(zhì)發(fā)生分解，其中槲皮素等物質(zhì)轉(zhuǎn)換成了其他活性成分。

表7 黑苦蕎殼7種酚類物質(zhì)含量 mgGAE/100g

2.6 黑苦蕎殼顆粒微觀形態(tài)觀察

為了研究黑苦蕎殼膳食纖維樣品的形態(tài)差異，運(yùn)用掃描電鏡對(duì)烘烤及未烘烤黑苦蕎殼進(jìn)行了形態(tài)分析。如圖3所示為水分含量分別為10.02%和13.05%未烘烤及烘烤的樣品，在200倍和400倍下觀察其結(jié)構(gòu)大致相似，但放大800倍及3000倍時(shí)可以清晰地看出，未烘烤黑苦蕎殼粉體形狀呈橢圓形或球狀結(jié)構(gòu)，顆粒較規(guī)則且分布均勻，在放大到800倍下測(cè)量粒徑大小均值為（9.40±0.75)μm。烘烤后樣品表面較粗糙，纖維顆粒的晶體顆粒大小不均勻，結(jié)構(gòu)多樣變得無(wú)定形(見(jiàn)圖3中 A2、B2、C2、D2)，這可能是因?yàn)榻?jīng)烘烤后樣品水分散失，而水分是保持樣品細(xì)胞完整性的重要屬性。這與Chiang等[29-30]的研究結(jié)論一致。

圖3 黑苦蕎殼粉結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究采用單因素和響應(yīng)面法對(duì)黑苦蕎殼烘烤工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳工藝條件為烘烤時(shí)間12 min、烘烤溫度75℃和鋪盤厚度1.4 cm。此試驗(yàn)條件下，測(cè)得實(shí)際總黃酮含量為9.1 mg RE/g，總酚含量為38.9 mg GAE/g。在影響黑苦蕎殼烘烤工藝的各個(gè)因素中，烘烤溫度和烘烤時(shí)間影響效果最為顯著。隨著烘烤溫度和時(shí)間的增加，其黃酮及總酚含量隨烘烤溫度的升高而降低，烘烤后營(yíng)養(yǎng)成分也有所變化。通過(guò)HPLC測(cè)定最佳烘烤工藝條

件下黑苦蕎殼沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、對(duì)香豆酸、槲皮素、山奈酚含量分別為14.10 mg GAE/100g，0.758 mg GAE/100g、1.626 mg GAE/100g、1.140 mg GAE/100g、0.772 mg GAE/100g、11.96 mg GAE/100g、0.52 mg GAE/100g，其中沒(méi)食子酸與未烘烤組相比含量增加最多，相對(duì)提高了30.4%。

本研究為黑苦蕎殼產(chǎn)品加工處理提供了一定的理論支撐，該烘烤工藝可進(jìn)一步用于黑苦蕎殼保健食品、餅干、復(fù)合飲料、奶茶等相關(guān)產(chǎn)品研究與開(kāi)發(fā)，后期可進(jìn)一步對(duì)烘烤后的黑苦蕎殼活性成分及其特性進(jìn)行研究。