汪杰，孫向陽(yáng)，姚紅梅，張恕銘，李嬋媛，鄭淼心，張慶

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039）

類(lèi)胡蘿卜素作為有益的有機(jī)色素，天然存在于光合生物體內(nèi)。同時(shí)，這些物質(zhì)也常被發(fā)現(xiàn)存在于某些非光合生物中，它們主要起保護(hù)細(xì)胞免受光和氧氣損壞的作用[1?2]。作為一種重要的脂溶性色素，類(lèi)胡蘿卜素除了其具有的顏色和采光特性外，還具有多種生物活性和化學(xué)特性[3]。它們常表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化能力、抗腫瘤和抗微生物特性，在食品、飼料、化妝品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[4?6]。目前類(lèi)胡蘿卜素的制備有化學(xué)合成法、植物提取法和微生物發(fā)酵法。其中，微生物發(fā)酵生產(chǎn)色素具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、易進(jìn)行基因工程改造、不受季節(jié)因素的影響等特點(diǎn)而成為目前的研究重點(diǎn)[3,7]。

產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的微生物主要有霉菌、酵母、藻類(lèi)和細(xì)菌等。Kaur等[8]以水果和蔬菜廢料為發(fā)酵底物，對(duì)一株Blakeslea trispora(+)MTCC 884產(chǎn)β-胡蘿卜素進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，優(yōu)化后的β-胡蘿卜素產(chǎn)量為0.127 mg/mL?？拙S寶等[9]對(duì)分離自土壤中的一株膠紅酵母K-1產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)條件優(yōu)化，優(yōu)化后的類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)（180.14±2.45）μg/g (DCW)。Singh等[10]對(duì)一株香榧綠藻PUMCC5.1.1進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，總類(lèi)胡蘿卜素可達(dá)118μg/g (DCW)。但目前能工業(yè)化生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的菌株還十分有限，而光合細(xì)菌、酵母、霉菌以及藻類(lèi)又因其自身的種種限制而無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)[11]，因此從自然界中篩選獲得優(yōu)良類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)生菌仍具有相當(dāng)大的研究?jī)r(jià)值。戈登氏菌作為革蘭氏陽(yáng)性菌的一種，在合成類(lèi)胡蘿卜素方面表現(xiàn)出不俗的能力。Sowani等[12]從碳?xì)浠衔镂廴镜臒釒寥乐蟹蛛x獲得一株Gordonia amicalisHS-11，該菌株除產(chǎn)表面活性劑外，還具有產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的能力，其含量可達(dá)（2.9±0.10）mg/g (DCW)。Silva等[13]研究發(fā)現(xiàn)，G.alkanivorans1B具有產(chǎn)生葉黃素、角黃素以及蝦青素的能力，其總類(lèi)胡蘿卜素含量可達(dá)2.015 mg/g (DCW)。Loh等[14]從臺(tái)灣北部海水中分離得到一株Gordonia terraeTWRH01，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基成分，得到15.29 g/L的菌體量以及10.58μmol/L的相對(duì)β-胡蘿卜素濃度。

本研究以傳統(tǒng)釀造郫縣豆瓣為原料，分離、篩選鑒定產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素菌株，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)之上，通過(guò)Box-Behnken中心組合法對(duì)菌株產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)菌株產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素進(jìn)行抗氧化能力分析，旨在為微生物發(fā)酵制備類(lèi)胡蘿卜素提供菌種資源和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

傳統(tǒng)釀造的郫縣豆瓣：成都市郫都區(qū)某郫縣豆瓣公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酸水解酪素5 g/L，酵母膏10 g/L，細(xì)菌蛋白胨5 g/L，檸檬酸三鈉3 g/L，氯化鉀3 g/L，硫酸鎂18 g/L，氯化鈣0.2 g/L，硫酸亞鐵0.001 g/L，氯化鈉5 g/L，蒸餾水1000 mL，121°C滅菌20 min，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖25 g/L，氯化鉀5 g/L，氯化鎂0.5 g/L，硫酸亞鐵0.015 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，磷酸氫二鈉3 g/L，檸檬酸鈉2 g/L，蒸餾水1000 mL，121℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂粉。

1.1.3 儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)（Multifuge XIR），賽默飛世爾科技（中國(guó)）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon3500R），廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司；制冷恒溫?fù)u床（HNY-2102C），天津歐諾儀器儀表有限公司；雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV2800PC），上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（Scientz-IID），寧波新芝生物科技有限公司；電子天平（JA2003），上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

取1.0 g郫縣豆瓣于100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中30℃光照培養(yǎng)5 d，將100μL菌液溶于900μL無(wú)菌生理鹽水中以10倍稀釋法依次稀釋至10-7，涂布挑取產(chǎn)色素的單菌落。

1.2.2 菌株的鑒定

對(duì)篩選的菌株平板劃線(xiàn)純化并觀(guān)察其菌落顏色形態(tài)。生理生化試驗(yàn)參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[15]中的分析方法進(jìn)行。提取純化后的菌株DNA進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較，并選取相似度高的菌株構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 類(lèi)胡蘿卜素的提取和定性

類(lèi)胡蘿卜素的超聲破碎提取參照李超[16]的方法進(jìn)行。

取少量色素三氯甲烷浸提液于干凈的試管中，滴加1～2滴濃硫酸觀(guān)察溶液顏色變化。若溶液變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)綠色，證明可能存在類(lèi)胡蘿卜素[17]。采用紫外?可見(jiàn)吸收光譜（UV-Vis）將上述得到的色素粗提液在300～600 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，記錄吸收光譜，并對(duì)該色素的特征吸收峰進(jìn)行光譜分析[18?19]。

1.2.4 類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量測(cè)定

參照孔維寶等[9]的計(jì)算公式對(duì)類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以丙酮為提取劑，選擇培養(yǎng)時(shí)間、接種量、初始pH和裝液量等參數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察其對(duì)類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。各因素的梯度設(shè)置分別為：培養(yǎng)時(shí)間為24、48、72、96、120、144、168 h；接種比為1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%；初始pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；裝液量為50、60、70、80、90、100、110 mL（250 mL錐形瓶）。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取各因素的最佳值為響應(yīng)面的中心點(diǎn)，利用Design-Expert 8.0.6軟件，以類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定菌株產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)條件。因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平表

1.2.7 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考Liu等[20]的試驗(yàn)方法對(duì)DPPH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 羥基自由基清除能力測(cè)定

參考侯靖等[21]的試驗(yàn)方法對(duì)羥基自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[22]對(duì)超氧陰離子自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，圖形利用Origin 8.5軟件繪制，利用IBM SPSS statistics 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化

從郫縣豆瓣中篩選獲得一株產(chǎn)色素菌株GH-1，該菌株在固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌落顏色為橘黃色，形狀為圓形，不透明，凸起有褶皺（圖1（a））。在顯微鏡下觀(guān)察到菌株為長(zhǎng)桿狀，革蘭氏染色為陽(yáng)性（圖1（b））。

圖1 菌株GH-1的形態(tài)特征

2.2 菌株生理生化和分子生物學(xué)鑒定

菌株GH-1生理生化結(jié)果如表2所示。為明確菌株GH-1的分類(lèi)學(xué)地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將菌株的16S rRNA序列利用BLAST檢索分析，同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖2所示，菌株GH-1被鑒定為暗紅戈登氏菌（Gordonia rubripertincta）。

圖2 基于菌株GH-116S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表2 菌株GH-1生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 菌株GH-1類(lèi)胡蘿卜素提取物定性

將菌株GH-1的類(lèi)胡蘿卜素甲醇提取液在300～600 nm全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株類(lèi)胡蘿卜素提取液在479 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，符合類(lèi)胡蘿卜素在可見(jiàn)光的吸收范圍，且其UV-Vis光譜具有類(lèi)胡蘿卜素紫外光譜典型的三指峰特點(diǎn)[23]。與Goswami等[24]在473 nm波長(zhǎng)處得到的類(lèi)胡蘿卜素最大吸收峰比對(duì)，也初步證實(shí)菌株GH-1的色素產(chǎn)物為類(lèi)胡蘿卜素。同時(shí)濃硫酸顯色反應(yīng)表明，類(lèi)胡蘿卜素粗提液與濃硫酸的交接處有藍(lán)綠色的光環(huán)出現(xiàn)，也為菌株GH-1產(chǎn)色素為類(lèi)胡蘿卜素提供了依據(jù)[25]。

1.2.5 椎動(dòng)脈供血 采用彩色多普勒超聲儀檢測(cè)椎動(dòng)脈的平均血流速度，由專(zhuān)人操作，儀器設(shè)定正常值標(biāo)準(zhǔn)參照。

圖3 菌株GH-1的類(lèi)胡蘿卜素粗提液UV-Vis光譜

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖4（a）可知，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，菌株色素產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到144 h時(shí)，色素產(chǎn)量最高，為（4.21±0.10）mg/L。隨后色素產(chǎn)量下降，可能是因?yàn)殡S著營(yíng)養(yǎng)消耗，菌體生長(zhǎng)受到抑制，使色素合成受到影響[14]。因此，選擇培養(yǎng)時(shí)間為144 h。

菌株GH-1色素產(chǎn)量受接種量影響如圖4（b）所示。色素產(chǎn)量隨接種量的增加而逐漸增加。色素產(chǎn)量在接種量為8%時(shí)最大，為（4.88±0.20）mg/L。繼續(xù)增大接種量，色素產(chǎn)量開(kāi)始減少，可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)大導(dǎo)致培養(yǎng)基溶氧不足從而影響菌體的生長(zhǎng)以及產(chǎn)物的生成[26]。因此，選擇接種量為8%。

培養(yǎng)基的初始pH值是影響菌體生長(zhǎng)以及代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的一個(gè)重要參數(shù)，它通過(guò)影響菌體內(nèi)相關(guān)酶的反應(yīng)以及細(xì)胞膜對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收從而產(chǎn)生影響[27]。由圖4（c）可知，菌株GH-1在酸性環(huán)境下不適合生長(zhǎng)，但隨pH的升高，色素產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)pH為7.0時(shí)，菌株GH-1的色素產(chǎn)量達(dá)到最大，為（5.47±0.20）mg/L。此后色素產(chǎn)量隨著pH的升高而逐漸下降且趨于穩(wěn)定。因此，選擇初始pH為7.0。

裝液量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)在對(duì)其傳氧系數(shù)以及氧溶解量的影響[28]。由圖4（d）可知，最佳的裝液量為60 mL，此時(shí)色素產(chǎn)量達(dá)到最大，為（6.39±0.10）mg/L。此后菌株色素產(chǎn)量隨著裝液量的增加而明顯降低。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間、接種量、初始pH和裝液量對(duì)菌株GH-1色素產(chǎn)量的影響

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)分析基礎(chǔ)上，以培養(yǎng)時(shí)間144 h，接種量8%、pH 7.0和裝液量60 mL/250 mL為響應(yīng)面分析中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6軟件將表3所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，4個(gè)因素經(jīng)回歸擬合得到以色素產(chǎn)量為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：

表4 響應(yīng)面方差分析

各因素交互作用響應(yīng)曲面圖如圖5所示。圖5（a）曲面最陡，說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間和接種量的交互作用對(duì)色素產(chǎn)量的影響最為顯著。對(duì)回歸模型方程求導(dǎo)，得到最大色素預(yù)測(cè)值產(chǎn)量為7.25 mg/L，此時(shí)對(duì)應(yīng)變量的最佳值為：培養(yǎng)時(shí)間145.49 h、接種量7.93%、pH 7.11和裝液量59.78 mL/250 mL。

圖5 發(fā)酵條件交互作用對(duì)色素生物合成量的影響響應(yīng)面立體圖

2.6 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證和優(yōu)化

進(jìn)一步對(duì)預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證，并將條件優(yōu)化為：培養(yǎng)時(shí)間145 h、接種量8%、pH 7.0和裝液量60 mL/250 mL。結(jié)果得出在此優(yōu)化條件下色素產(chǎn)量為7.24 mg/L，與預(yù)測(cè)值（7.25 mg/L）基本一致，表明該響應(yīng)面回歸模型可靠。與未優(yōu)化前相比，色素產(chǎn)量提高了1.95倍。

2.7 菌株GH-1產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素抗氧化能力測(cè)定

菌株GH-1產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素對(duì)3種常見(jiàn)自由基的清除能力如圖6所示。由圖6（a）可知表明，隨色素質(zhì)量濃度升高，菌株GH-1產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素對(duì)DPPH自由基的清除能力不斷增強(qiáng)。當(dāng)色素質(zhì)量濃度達(dá)到200μg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率為67.00%，表明該色素具有良好的DPPH自由基清除能力。

羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力結(jié)果如圖6（b）和圖6（c）所示。在所有質(zhì)量濃度下（40、80、120、160、200μg/mL），色素對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用均隨著色素質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)色素質(zhì)量濃度為200μg/mL時(shí)，羥基自由基的清除率最大為54.30%，與40μg/mL Vc的清除能力接近；超氧陰離子自由基的清除率為44.10%，表明該色素具有一定的羥基自由基和超氧陰離子自由基清除能力，綜上顯示該色素分子可作為一種潛在的抗氧化劑。

圖6 菌株GH-1類(lèi)胡蘿卜素抗氧化活性評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

從傳統(tǒng)釀造郫縣豆瓣中篩選、鑒定得到一株產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的暗紅戈登氏菌（Gordonia rubripertincta）GH-1。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化菌株GH-1產(chǎn)色素的條件，得到最佳的菌株產(chǎn)色素培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間145 h、接種量8%、pH 7.0和裝液量60 mL/250 mL，在此優(yōu)化條件下類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)7.24 mg/L。菌株GH-1產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素對(duì)DPPH、羥基自由基和超氧陰離子自由基有較強(qiáng)的清除能力，表明菌株GH-1產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素可作為潛在抗氧化劑。本研究表明，暗紅戈登氏菌GH-1具有發(fā)酵高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)類(lèi)胡蘿卜素的潛能，可作為優(yōu)質(zhì)功能性產(chǎn)色素微生物資源深入研究。