王 慧,郭俊杰,李先根,任效瑞,劉玉蘭,楊彩梅,朱惠玲*
(1.武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室,湖北武漢 4 300232;2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司,浙江安吉 313307)
仔豬斷奶應(yīng)激在規(guī)?;?、集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中日益成為一個比較嚴重的問題,給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。斷奶應(yīng)激激活相關(guān)應(yīng)激信號通路,導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損,繼而引起仔豬發(fā)生腹瀉。甘氨酸(Gly)作為幼齡哺乳動物條件性必需氨基酸,具有抗炎、促進蛋白質(zhì)合成、抑制氧化應(yīng)激等功能。研究表明,體外添加Gly 對腸黏膜屏障功能有調(diào)控作用。因此,本試驗用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)仔豬腸黏膜損傷,探究在日糧中添加Gly 對斷奶仔豬腸黏膜屏障損傷的保護作用,為養(yǎng)豬生產(chǎn)提供借鑒。
1.1 試驗設(shè)計 選用體重相近的(21±1)日齡杜× 長× 大斷奶仔豬24 頭,平均體重為(7.17±0.17)kg,隨機分為4 組,每組6 個重復(fù)(欄),每欄1 頭豬。4 個處理組分別為對照組(基礎(chǔ)日糧)、LPS 組(基礎(chǔ)日糧+LPS)、1.0% Gly 組(基礎(chǔ)日糧+1.0% Gly+LPS)(L-Gly,有效成分均大于99%,武漢阿米諾科技有限公司)、2.0% Gly 組(基礎(chǔ)日糧+2.0% Gly+LPS)。預(yù)飼7 d,正試期28 d。在試驗第28 天,對照組注射無菌生理鹽水,LPS 組、1.0% Gly 組和2.0% Gly 組仔豬腹腔注射LPS(大腸桿菌血清型O55:B5,Sigmaaldrich,美國),劑量為100 μg/kg BW?;A(chǔ)日糧配制參照NRC(2012)仔豬營養(yǎng)需要,按照文獻配方配制。各組日糧用丙氨酸進行等氮處理。
1.2 小腸樣品采集 試驗第28 天,注射LPS 或生理鹽水4 h 后,仔豬麻醉、屠宰,取空腸、回腸黏膜標本,置于超低溫冰箱-80℃保存。另取空腸和回腸2 cm 用于小腸形態(tài)學觀察(4%多聚甲醛固定,HE 染色)。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 生長性能測定 在試驗開始第1 天和第28 天,空腹12 h 后仔豬稱重,記錄采食量,計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和耗料增重比(F/G)。
1.3.2 抗氧化指標測定 按照商品試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書測定空腸、回腸的黏膜谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平。
1.3.3 細菌移位率及移位細菌數(shù)測定 無菌采集仔豬的脾臟、肝臟以及腸系膜淋巴結(jié),稱取脾臟、肝臟及腸系膜淋巴結(jié)約0.1 g,勻漿、接種至鮮血-麥康凱培養(yǎng)基,于37℃細菌培養(yǎng)48 h,菌落計數(shù)。培養(yǎng)板上出現(xiàn)菌落定義為細菌移位陽性,計算細菌移位率,細菌移位率=移位組織個數(shù)/組織總數(shù)×織總數(shù)個;菌落計數(shù)用于計算移位細菌數(shù),移位細菌數(shù)的單位為log(CFU/g)。
1.3.4 小腸組織形態(tài)學觀察 參照Zhu 等方法測定絨毛高度、隱窩深度,并計算絨毛高度/隱窩深度值。
1.3.5 腸黏膜杯狀細胞計數(shù) 參照Zhu 等方法計數(shù)空腸、回腸杯狀細胞數(shù)及腸上皮細胞總數(shù),杯狀細胞數(shù)按公式計算,即杯狀細胞數(shù)=杯狀細胞數(shù)/腸上皮細胞總數(shù)×100%,取平均值為該組織杯狀細胞數(shù)。
1.3.6 嗜中性粒細胞、肥大細胞計數(shù) 參照Zhu 等方法對空腸、回腸嗜中性粒細胞、肥大細胞計數(shù),并測量視野面積,計算嗜中性粒細胞、肥大細胞密度,細胞密度=細胞數(shù)/視野面積,取平均值為該組織嗜中性粒細胞、肥大細胞密度。
1.3.7 小腸黏膜信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達量的測定 促腎上腺素皮質(zhì)激素釋放激素()、促腎上腺素皮質(zhì)激素釋放激素受體1()、促腎上腺素皮質(zhì)激素釋放激素受體2()、糖皮質(zhì)激素受體()、類胰蛋白酶()等mRNA水平采用Real-time PCR 分析。內(nèi)參基因為3-磷酸甘油醛脫氫酶(),采用2法計算。Realtime PCR 所需試劑購自大連寶生物工程有限公司,引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成,引物序列見表1。
表1 引物序列
1.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0 軟件進行單因素方差分析和LSD 多重比較,結(jié)果以平均值±標準誤表示,<0.05 為差異顯著,<0.10 為具有顯著性趨勢。
2.1 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬生長性能的影響 由表2可知,試驗第1~28 天各處理組ADG、ADFI 及F/G 沒有顯著差異。
表2 Gly 對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響
2.2 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜MDA 和GSH水平的影響 由圖1、2 可知,LPS 應(yīng)激顯著升高回腸MDA 水平(<0.05),降低空腸、回腸GSH 水平(<0.05);日糧添加1.0% Gly、2.0% Gly 緩解LPS應(yīng)激導(dǎo)致的回腸MDA 升高(<0.05)及GSH 降低(<0.05)。
圖1 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜MDA 水平的影響
2.3 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸形態(tài)學的影響 由表3 可知,與對照組相比,LPS 應(yīng)激使空腸絨毛高度/隱窩深度比值降低(<0.05),且有降低空腸絨毛高度趨勢(<0.1)。與LPS 組相比,日糧中添加Gly 對小腸結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。
表3 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸形態(tài)學的影響
2.4 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬細菌移位率及移位細菌數(shù)的影響 由表4、5 可知,與對照組相比,LPS 應(yīng)激增加細菌移位率;與LPS 組相比,日糧添加Gly 降低細菌移位率,但差異均不顯著。與對照組相比,LPS 應(yīng)激增加脾臟移位細菌數(shù)(<0.05),且有增加肝臟移位細菌數(shù)的趨勢(<0.1);與LPS 組相比,2.0% Gly 組肝臟移位細菌數(shù)顯著降低。
表4 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬細菌移位率的影響
圖2 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜GSH 水平的影響
2.5 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜免疫細胞的影響 由表6 可知,與對照組相比,LPS 應(yīng)激增加斷奶仔豬回腸肥大細胞密度(<0.05),且有增加空腸杯狀細胞數(shù)的趨勢(<0.1);與LPS 組相比,日糧添加1.0% Gly 降低空腸肥大細胞數(shù)及回腸嗜中性粒細胞密度(<0.05),且有降低回腸肥大細胞密度的趨勢(<0.1);而日糧添加2.0% Gly 有降低空腸嗜中性粒細胞密度的趨勢(<0.1)。
表5 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬移位細菌數(shù)的影響 log10(CFU/g)
表6 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜免疫細胞影響
2.6 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜信號通路相關(guān)基因mRNA 相對表達量的影響 由表7 可知,與對照組相比,LPS 應(yīng)激增加空腸(<0.05)、(<0.001)和(<0.05)及回腸(<0.001)的mRNA 相對表達量。與LPS 組相比,1.0%Gly 組空腸及回腸mRNA 相對表達量顯著降低,2.0% Gly 組空腸及回腸mRNA 相對表達量顯著降低。
表7 Gly 對LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜CRF/CRFR1信號通路相關(guān)基因表達的影響
Gly 是體內(nèi)最簡單的氨基酸,它不僅參與蛋白質(zhì)、嘌呤等合成,其在氧化損傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等方面也發(fā)揮重要作用。Gly 對動物腸黏膜屏障功能有一定的改善作用。本試驗用LPS 誘導(dǎo)仔豬腸黏膜損傷,探究Gly對斷奶仔豬腸黏膜屏障損傷的保護作用。
體內(nèi)外試驗發(fā)現(xiàn),LPS 應(yīng)激可使機體自由基(如活性氧)生成增多,抗氧化能力下降,最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激。MDA 水平反映組織氧化應(yīng)激的損傷程度,GSH 是評價機體抗氧化能力的指標。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,仔豬小腸黏膜MDA 含量升高。劉靜波等研究發(fā)現(xiàn)斷奶應(yīng)激降低仔豬小腸黏膜GSH 含量。本研究表明,LPS應(yīng)激導(dǎo)致小腸黏膜MDA 水平升高,GSH 水平降低,提示LPS 誘導(dǎo)仔豬氧化應(yīng)激;日糧中添加1% 或2% Gly顯著降低了MDA 水平和增加GSH 水平,說明Gly 緩解了LPS 導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。同樣,Wang 等研究發(fā)現(xiàn),Gly 可以抑制豬腸上皮細胞氧化應(yīng)激,維持腸道健康。Gly 是內(nèi)源性GSH 合成的底物,日糧添加Gly 可以促進谷胱甘肽合成,提高腸道抗氧化能力。此外,Gly 可以轉(zhuǎn)化為絲氨酸發(fā)揮抗氧化作用,繼而維持腸道穩(wěn)態(tài)。
氧化應(yīng)激可導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn),LPS 應(yīng)激會使腸絨毛呈現(xiàn)不同程度脫落,絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度比值降低,腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)受損,這與Zhu 等發(fā)現(xiàn)一致。腸黏膜結(jié)構(gòu)受損會導(dǎo)致腸黏膜通透性增加,腸腔細菌及其產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到腸系膜淋巴結(jié)和更遠的部位即細菌移位。細菌移位是評價腸黏膜屏障功能的重要指標。本研究中,LPS 應(yīng)激增加脾臟、肝臟移位細菌數(shù),而日糧中添加2% Gly 可使肝臟移位細菌數(shù)降低,腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能改善。Li 等對近交豬自體小腸移植發(fā)現(xiàn),Gly-Gln 二肽可顯著減少肝、脾及腸系膜淋巴結(jié)細菌數(shù),降低腸道通透性。Gly可為細胞合成嘌呤和嘧啶提供一碳單位,從而促進腸黏膜細胞的更新及損傷修復(fù)。此外,Gly 緩解了LPS 應(yīng)激導(dǎo)致的炎性細胞(嗜中性粒細胞)浸潤,這可能與Gly的免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。
應(yīng)激導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙機理還不甚清楚,一般認為與CRF 及其受體CRFR1 信號通路激活有關(guān)。CRF 是一種由41 個氨基酸組成的下丘腦肽,是應(yīng)激和免疫/ 炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。CRF 的受體包括CRFR1 和CRFR2,CRFR2 參與腸黏膜損傷的修復(fù),而CRFR1 則與CRF 結(jié)合激活肥大細胞。Smith 等研究表明,CRF 通過激活肥大細胞釋放類胰蛋白酶誘導(dǎo)腸上皮屏障損傷。肥大細胞是一種造血來源的免疫細胞,可遷移到外周組織成熟并調(diào)節(jié)多種效應(yīng)功能。此外,CRF也可以促進皮質(zhì)醇釋放,皮質(zhì)醇與腸黏膜糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙。本研究表明,LPS 應(yīng)激增加了空腸、回腸和相對mRNA 的表達及肥大細胞密度,說明LPS 激活了CRF/CRFR1 信號通路;日糧中添加1% Gly 通過降低空腸、回腸和mRNA 的水平及肥大細胞密度來保護腸黏膜免受LPS 應(yīng)激損傷。Gly 對CRF/CRFR1 信號通路的影響未見報道。Ruiz-Ramírez 等研究發(fā)現(xiàn),Gly 可以緩解大鼠氧化應(yīng)激,保護血管組織。本試驗說明Gly 可能通過調(diào)節(jié)CRF/CRFR1 信號通路緩解LPS 應(yīng)激導(dǎo)致的腸黏膜損傷,從而保護腸黏膜屏障功能的完整性。
本試驗結(jié)果顯示,斷奶仔豬日糧添加1% Gly 可以緩解LPS 應(yīng)激導(dǎo)致的CRF/CRFR1 信號通路相關(guān)基因的過量表達,降低細菌移位率及移位細菌數(shù),提高腸道抗氧化能力,維持腸黏膜屏障功能的完整性。