高效液相色譜法測定普洱熟茶中鞣花酸含量

許芮菁，劉敏，楊銳，高林瑞，丁章貴，3，4*，陳丹丹*

（1.云南大益微生物技術有限公司，云南昆明 650217；2.云南省普洱茶發(fā)酵工程研究中心，云南昆明 650217；3.云南大學生命科學學院云南省微生物研究所，云南昆明 650091；4.云南大學西南微生物多樣性教育部重點實驗室，云南昆明 650091）

鞣花酸（Ellagic acid，EA）是一種具有生物活性的酚類化合物，廣泛存在于水果、堅果等植物組織中[1]，其結構如圖1 所示，是一種沒食子酸的二聚衍生物。 在自然界中， 鞣花酸主要以縮合形式（如鞣花單寧等）存在[2]。鞣花酸基本無毒性[3]，對化學物質誘導的癌變及其它多種癌變具有明顯的抑制作用，如結腸癌[4-5]、肝癌[6]、肺癌[7]、前列腺癌[8-9]、乳腺癌[10]、淋巴癌[11]等。此外，鞣花酸還具有抗氧化[12]、抗炎癥[13]、抑菌[14]、抑制黑色素生成[15]、改善白血病[16]等功效。 由于其優(yōu)異的生物活性，鞣花酸被廣泛應用于保健食品[17-18]、醫(yī)療[19-20]、醫(yī)藥[21-22]、化妝品[23-25]等領域。

圖1 鞣花酸分子結構式Fig.1 The molecular structures of EA

有研究表明， 茶葉是鞣花單寧和鞣花酸的重要膳食來源，鞣花單寧通過人體腸道微生物轉化，會轉化為鞣花酸等代謝產物[26]。普洱熟茶作為云南名茶， 是由云南大葉種曬青毛茶制成的一種獨特微生物發(fā)酵茶[27]。普洱熟茶“固態(tài)發(fā)酵”的實質主要是濕熱作用、酶作用以及微生物作用[28]。 大葉種曬青毛茶發(fā)酵過程中，微生物代謝釋放大量熱量，其分泌的酶與茶葉內含物發(fā)生激烈的酶促反應，二者均能促進具有熱不穩(wěn)定性的鞣花單寧（如木麻黃素）[29]分解形成鞣花酸。 建立普洱熟茶中鞣花酸含量的檢測方法， 可滿足普洱熟茶中特征活性成分的質量控制需求， 同時有助于普洱茶發(fā)酵過程中特征性物質的變化趨勢及微生物的代謝規(guī)律研究，為普洱茶的工業(yè)化可控發(fā)酵提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國，Waters公司）；Waters 2995 PDA （光電二極管列陣檢測器，美國，Waters 公司）；WD-9415B 超聲儀（北京六一儀器廠）；H1850R 低溫離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；VORTEX 3 旋渦混勻器（德國，IKA公司）；分析天平（精度0.0001 g，美國，OHAUS 公司）；Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm，美國，Agilent 公司）。

1.2 材料與試劑

針式過濾器（0.45 μm，尼龍66，天津津騰實驗設備有限公司）； 乙腈、 甲醇均為色譜純 （德國MERCK 公司）；水為超純水；磷酸為分析純；鞣花酸對照品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；0～20 min，0.2%磷酸∶乙腈（85∶15，體積比），等度洗脫；流速：1 mL/min；進樣量為10 μL，柱溫35 ℃；光電二極管陣列檢測器；檢測波長245 nm。

1.4 標準溶液的配制

稱取一定量的鞣花酸對照品， 用甲醇溶解配制成質量濃度為60 mg/L 的標準儲備液， 于-4 ℃避光保存。使用前，準確移取適量鞣花酸標準儲備液， 用甲醇配置成質量濃度分別為1～30 mg/L 的標準系列工作液，于-4 ℃避光保存[10]。

1.5 樣品處理

稱取適量（精確至0.0001 g）均勻研磨的熟茶樣品于50 mL 離心管中，加入適量提取溶劑（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、純甲醇），使料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 和1∶50，超聲一定時間（30 min、45 min、60 min），5000 r/min 下離心10 min，取上清液于100 mL 容量瓶中，重復數(shù)次（重復0次、1 次、2 次和3 次， 即提取1 次、2 次、3 次和4次），合并上清液，用純水定容至100 mL，搖勻，過0.45 μm 水相濾膜后，待測。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜條件優(yōu)化

使用水-甲醇、水-乙腈、磷酸水溶液-甲醇和磷酸水溶液-乙腈（磷酸濃度為0.2%、0.3%、1%）為流動相，等度洗脫，考察不同流動相種類、比例及pH 對普洱熟茶中鞣花酸分離效果的影響。 從目標峰的峰形、與干擾峰的分離度等方面進行評價。

結果表明，流動相為水-有機相體系時，鞣花酸的色譜峰展寬、拖尾嚴重，識別困難。 在洗脫體系中加入不同濃度的磷酸進行峰形優(yōu)化， 鞣花酸色譜峰的峰寬變窄，峰形對稱略有拖尾。但不同濃度的磷酸，對峰形變化影響不明顯，因此洗脫體系選用0.2%磷酸的濃度。 分別使用甲醇和乙腈有機相洗脫鞣花酸對照品， 發(fā)現(xiàn)乙腈洗脫體系鞣花酸的保留時間更短， 且水溶液-乙腈體積比為85∶15時樣品中鞣花酸目標峰前后雜質峰較少， 利于定性和定量，能顯著提高檢測效率。 因此，確定普洱熟茶中鞣花酸定量檢測的流動相為0.2%磷酸水溶液-乙腈 （體積比為85∶15）， 保留時間為16.0 min（±0.5 min），如圖2 所示。

圖2 鞣花酸對照品和普洱熟茶樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of EA in reference substance and in Pu-erh ripe tea sample

2.2 樣品前處理優(yōu)化

分別研究不同料液比、不同提取液種類、不同提取時間和不同提取次數(shù)對鞣花酸提取率的影響。 在相同檢測條件下對比鞣花酸色譜峰和雜質色譜峰（咖啡因等）的峰高或含量，從而確定最優(yōu)的前處理方法。

如圖3 所示，1∶30、1∶40、1∶50 提取組鞣花酸含量顯著低于1∶20 提取組，鞣花酸含量隨料液比降低而顯著降低，而1∶10、1∶20 提取組間鞣花酸含量無顯著差異，當料液比為1∶10 時，咖啡因峰高超過2.0 AU，沒食子酸峰高達1.8 AU，考慮到過大響應值可能對檢測器造成損耗，因此，1∶20 為最適料液比。

選擇水、 甲醇以及不同比例甲醇水為提取溶劑， 評價普洱熟茶中鞣花酸的提取率。 如圖4 所示，與水提取組相比，純甲醇、75%甲醇組鞣花酸提取率顯著低于水提取組，50%甲醇、25%甲醇組鞣花酸提取率低于水組，但無顯著差異，綜合考慮實驗成本及環(huán)境污染等因素，選擇水為最適提取液。

考慮不同提取時間對普洱熟茶中鞣花酸提取率的影響。如圖5 所示，鞣花酸含量隨著提取時間的增加而增加， 但提取30 min 與提取45 min 相比無顯著差異，為提高檢測效率，確定提取時間為30 min。

考慮不同提取次數(shù)對普洱熟茶中鞣花酸提取率的影響，根據(jù)已確定的料液比（1∶20）、提取液（水）和提取時間（30 min），分別超聲提取1 次、2次、3 次和4 次。 如圖6 所示，鞣花酸含量隨著提取次數(shù)的增加而增加， 提取3 次與提取1 次和2次相比有顯著差異， 且與提取4 次相比有差異但不顯著，考慮到檢測時長和檢測效率，最終采用3次提取。

圖3 不同料液比對鞣花酸含量的影響Fig.3 Effect of different ratio of material to liquid on content of EA

圖4 不同提取液對鞣花酸含量的影響Fig.4 Effect of different extracts on content of EA

圖5 不同提取時間對鞣花酸含量的影響Fig.5 Effect of different extraction time on content of EA

圖6 不同提取次數(shù)對鞣花酸峰含量的影響Fig.6 Effect of different extraction times on peak area of EA

2.3 方法線性范圍與相關系數(shù)

采用上述所確定的方法檢測鞣花酸對照品，外標法定量，以其峰面積為縱坐標（y 軸），其濃度為橫坐標（x 軸）做標準曲線，線性方程、相關系數(shù)見表1。 在0.6～60 mg/L 范圍內鞣花酸的線性良好。 鞣花酸的檢出限（LOD）[30]為13.5 mg/kg，定量限（LOQ）[31]為檢出限的3.33 倍，即45.0 mg/kg。

表1 鞣花酸的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 The Linear equation，correlation coefficient，detection and quantitative limit of EA

2.4 儀器精密度、方法重現(xiàn)性

取上述同一鞣花酸標準溶液，重復進樣6 次，進樣量10 μL，以鞣花酸峰面積，計算其相對標準偏差（RSD）為0.28%（n=6）。

根據(jù)“1.5”所述，按照最終確定的前處理方法進行同一樣品平行實驗，每個平行樣品進樣1 次，進樣量10 μL，以各樣品的鞣花酸含量，計算其相對標準偏差（RSD）為3.7%（n=6），表明該方法重復性較好。

2.5 普洱熟茶中鞣花酸的含量

對18 個市售普洱熟茶中鞣花酸的含量進行測定， 結果見表2。 樣品中鞣花酸含量范圍為176.6～398.1 mg/kg。

3 討論

不同普洱熟茶中鞣花素含量差異明顯。 普洱熟茶中的鞣花酸可能由茶葉中的鞣花單寧類物質轉化而來，不同等級、不同地區(qū)的原料鞣花單寧類物質含量不同， 且發(fā)酵程度不同也會影響普洱熟茶中鞣花酸的含量， 具體的影響因素及影響程度有待進一步研究。

目前， 利用高效液相色譜法測定鞣花酸含量的文獻中，檢測對象多為水果和藥用植物，涉及普洱茶中鞣花酸含量的檢測方法鮮有報道。 部分文獻[32-33]中所述方法提取過程漫長、提取溶液種類復雜且環(huán)境危害較大。或因儀器條件配適度較差，目標物與雜質峰未有效分離，導致定量結果不準確。

文章所述方法不僅可用于普洱熟茶中鞣花酸的含量測定，也適用于普洱熟茶深加工產品，且為普洱熟茶發(fā)酵過程中鞣花酸變化趨勢的研究提供方法基礎。 現(xiàn)行大部分檢測方法使用的提取溶劑為有機試劑， 前處理包括長時間浸泡或水浴回流及濃縮、蒸干等步驟，相較于這些方法，本方法僅使用純水超聲提取，方法便捷、成本低廉、環(huán)境危害小、可批量前處理。 且方法檢測周期較短，樣品前處理2 h，比其他需要有機試劑預先浸泡數(shù)小時再提取的方法更高效。 本方法目標峰前后雜質峰少且較小，分離度較文獻方法高，可有效定量目標峰。

表2 18 個市售普洱熟茶中鞣花酸含量（n=3）Table 2 Contents of ellagic acid in 18 commercially available Pu-erh ripe teas（n=3）