呂佳寧 丁葵英 郭禮強(qiáng) 許文娟 田國(guó)寧

1.濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院 山東濰坊 261043

2.濰坊海關(guān) 山東濰坊 261041

近年來(lái)，隨著生態(tài)循環(huán)，農(nóng)藥也不斷污染動(dòng)物源性食品，各國(guó)都不斷增加動(dòng)物源性食品中農(nóng)藥殘留限量種類和降低限量值。GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》也對(duì)部分農(nóng)藥殘留限量作了規(guī)定[1]。雞肉中因含有脂肪、蛋白質(zhì)等，所以測(cè)定其中的農(nóng)藥殘留相對(duì)復(fù)雜，傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)凈化方法操作繁瑣、試劑消耗量大、污染嚴(yán)重等，這些方法逐漸被當(dāng)前流行QuEChER(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe)法所取代，該法因可有效提高工作效率，降低環(huán)境污染[2～4]，被廣泛應(yīng)用于食品中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)。在QuEChER法中吸附劑材料的性能，直接制約著農(nóng)藥殘留測(cè)定方法的效率，所以新型高效吸附凈化材料的制備和應(yīng)用是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[5,6]。多壁碳納米管(multi walled carbon nanotubes,MWCNTs)是近年來(lái)逐漸流行的新型納米吸附材料，它是由多層六角碳網(wǎng)層面卷成的同軸圓筒狀的碳納米管[7]，由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)，如大比表面積、易于功能化等[8～11]，使其對(duì)有機(jī)物具有很強(qiáng)的吸附能力和選擇性，因此增加了對(duì)色素、脂肪等干擾物的選擇性[12,13]，并且通過(guò)表面去活技術(shù)，控制了材料對(duì)藥物的過(guò)分吸附，保證了敏感性農(nóng)藥的回收率，故被廣泛應(yīng)用到禽肉[14]、土壤[15]和茶葉[16]中的農(nóng)藥殘留分析。近年來(lái)，液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)由于兼具液相色譜的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性特點(diǎn)[17]，逐漸成為農(nóng)藥殘留分析的有效手段。雞肉中同類多農(nóng)藥殘留同時(shí)測(cè)定雖有報(bào)道[18,19]，但對(duì)于不同種類的多農(nóng)藥殘留同時(shí)測(cè)定報(bào)道較少。

試驗(yàn)采用MWCNTs凈化技術(shù)聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析手段，同時(shí)測(cè)定雞肉中氨基甲酸之類、有機(jī)磷類、菊酯類等26種代表性農(nóng)藥的殘留量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司);

甲酸(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；

無(wú)水硫酸鎂(分析純，純度95%，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，使用前在500℃馬弗爐內(nèi)烘5h，20℃時(shí)取出冷卻備用)；

C18粉、PSA粉(Agela technologies inc公司)；

滅蠅胺、乙酰甲胺磷、涕滅威亞砜、涕滅威砜、久效磷、內(nèi)吸磷-S-亞砜、內(nèi)吸磷-S-砜、涕滅威、乙拌磷亞砜、乙拌磷砜、氯吡脲、氯蟲苯甲酰胺、亞胺硫磷、嘧菌酯、乙拌磷、氟甲腈、除蟲脲、氟蟲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、丙溴磷、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟啶脲、溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(乙腈中1 000μg/mL，北京壇默有限公司)；

長(zhǎng)多壁碳納米管(LMWCTNS,外徑為5～15nm,長(zhǎng)度為10～30μm，先豐納米公司)和短多壁碳納米管(SMWCNTS,外徑為5～15nm,長(zhǎng)度為2～10.5μm，先豐納米公司)。

雞肉樣品來(lái)自于報(bào)檢公司報(bào)檢樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)(安捷倫6470QQQ，美國(guó)Agilent公司)；

碾磨儀(GM 200，德國(guó)RETSCH公司)；

高速分散均質(zhì)器(IKA-T25，德國(guó)IKA公司)；

電子天平(PB403-S，瑞士Mettler公司)；

離心機(jī)(Eppendof 5810R，德國(guó)Eppendof公司)；

渦流混勻器(MS3 basic，德國(guó)IKA公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1.1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

分別準(zhǔn)確移取100μL的1 000μg/mL的液體標(biāo)準(zhǔn)溶液(滅蠅胺、乙酰甲胺磷、涕滅威亞砜、涕滅威砜、久效磷、內(nèi)吸磷-S-亞砜、內(nèi)吸磷-S-砜、涕滅威、乙拌磷亞砜、乙拌磷砜、氯吡脲、氯蟲苯甲酰胺、亞胺硫磷、嘧菌酯、氟甲腈、除蟲脲、氟蟲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、丙溴磷、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟啶脲、溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品)和50μL的1 000μg/mL乙拌磷液體標(biāo)準(zhǔn)品于10mL的棕色容量瓶中，用乙腈稀釋定容，配制成乙拌磷為50μg/mL和其他25種標(biāo)準(zhǔn)品為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃下存放。

1.3.1.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL，用空白雞肉基質(zhì)提取溶液定容至1mL，得乙拌磷為2.5μg/mL和其他農(nóng)藥0.5μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液。精密移取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用空白樣品基質(zhì)溶液配制成其他農(nóng)藥為0.005～0.1μg/mL，乙拌磷為0.025～0.5μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

稱取10g試樣(精確至0.01g)于80mL離心管中，加入10mL乙腈，用高速組織搗碎機(jī)在15 000r/min，勻漿提取1min，加入4g無(wú)水硫酸鎂、1g氯化鈉，再勻漿提取1min，在5 000r/min離心5min，定量吸取上清液2mL至內(nèi)含無(wú)水硫酸鎂450mg，10mg多壁碳納米管粉末的塑料離心管中，渦旋混勻1min,5 000r/min離心5min，吸取上清液過(guò)微孔濾膜后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 LC-MS/MS條件

1.4.1 LC條件

色譜柱為SB-C18(3.0×100mm，2.7μm)；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為1μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫程序：0～1min，5%B；1～4min，5%～60%B；4～14min，60%～100%B；14～18min，100%B；18～18.1min，5%～100%B；18.1～21min，5%B。流速0.4mL/min，運(yùn)行21min.

1.4.2 MS條件

離子源為ESI；掃描方式為正負(fù)離子同時(shí)掃描；檢測(cè)方式為動(dòng)態(tài)多反應(yīng)檢測(cè)(dMRM)；干燥氣溫度為350℃；干燥氣流速為11L/min；霧化氣壓力為40psi。毛細(xì)管電壓為正4 000v，負(fù)2 500v，其他參數(shù)見表1所示，26種化合物0.01ug/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)總離子流圖如圖1所示。

表1 26種農(nóng)藥的質(zhì)譜分析參數(shù)

續(xù)表1

圖1 26種化合物0.01ug/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)總離子流圖

2 結(jié)果與討論

2.1 上機(jī)條件的建立

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行農(nóng)藥殘留測(cè)定的方法不僅關(guān)系到目標(biāo)化合物的分離度，同時(shí)也嚴(yán)重影響儀器靈敏度，所以建立合適的上機(jī)方法非常重要。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在水相中加入甲酸可以顯著提高26種化合物的響應(yīng)值，同時(shí)對(duì)比了甲醇和乙腈2種有機(jī)相對(duì)目標(biāo)分析物響應(yīng)值的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇作有機(jī)相各化合物的響應(yīng)值更好，試驗(yàn)經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索確定了1.4所述流動(dòng)相比例梯度和流速，應(yīng)用該方法26種化合物的色譜峰峰形和分離度都很好。

各化合物的質(zhì)譜參數(shù)參考安捷倫公司提供的藥品測(cè)定參數(shù)庫(kù)，但該參數(shù)庫(kù)缺少氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫脒等幾種化合物條件。采用以1μg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液不接色譜柱直接進(jìn)樣全掃描方式進(jìn)行掃描，選擇離子信號(hào)強(qiáng)的特征離子作為母離子，進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，將目標(biāo)農(nóng)藥的母離子打碎，選擇響應(yīng)值高的2個(gè)離子作為子離子，然后進(jìn)行碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)的優(yōu)化，最后建立動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(dMRM)模式，各質(zhì)譜參數(shù)見表1。dMRM模式避免了對(duì)多種化合物同時(shí)測(cè)定時(shí)通道分離的麻煩，有效提高各化合物的靈敏度。

2.2 吸附劑凈化能力的對(duì)比

農(nóng)藥殘留分析需要一種有效的凈化方法，特別是脂肪含量較高的雞肉基質(zhì)，為選取有效的吸附劑，本研究評(píng)價(jià)了長(zhǎng)短兩種MWCNTs(10mg和60mg)、PSA和C18(各75mg)混合粉末的凈化效果。經(jīng)過(guò)PSA和C18(75mg)組合后的樣品提取液，遠(yuǎn)不如經(jīng)過(guò)兩種MWCNTs凈化后的樣品，經(jīng)MWCNTs凈化后樣品去脂效率較好，同時(shí)LMWCNTs凈化后的樣品更加干凈。此外，從回收率看，8種物質(zhì)經(jīng)LMWCNTs凈化后回收率高于經(jīng)SMWCNTs凈化后的樣品，特別是滅蠅胺，回收率高出25.8%；雖經(jīng)SMWCNTs凈化后的樣品也有8種目標(biāo)化合物高于SMWCNTs凈化后的樣品，但高出最多不超過(guò)10%，其他幾種化合物回收率兩種MWCNTs凈化后目標(biāo)化合物回收率基本相同，這可能因?yàn)闆Q定MWCNTs吸附能力大小的主要因素是外徑尺寸[20]，而這2種MWCNTs的外徑尺寸相同，只是長(zhǎng)度不同，所以對(duì)基質(zhì)的凈化能力相差不大。綜合考慮26種化合物的回收率和凈化效果，選用LMWCNTs測(cè)定過(guò)程中的凈化吸附劑。

2.3 吸附劑用量的優(yōu)化

為了評(píng)估吸附劑用量的影響，研究了不同用量的吸附劑對(duì)回收率和凈化程度的影響。吸附劑材料從5mg逐漸增加到60mg。實(shí)驗(yàn)使用2mL乙腈提取物，加標(biāo)水平為0.04mg/kg，放入含有450mg硫酸鎂和不同數(shù)量的LMWCNTs(即5、10、15、30、60mg)的10.0mL離心管中。隨著LMWCNTs含量的增加，當(dāng)LMWCNTs的含量從5mg增加到15mg時(shí)，26種目標(biāo)化合物的回收率保持在一個(gè)相對(duì)恒定的水平(70.9%～96.7%)，回收率均在可接受的70%～110%范圍內(nèi)；然而，隨著LMWCNTs用量的增加，在15～60mg范圍，乙酰甲胺磷、氯吡脲、氯蟲苯甲酰胺、除蟲脲、苯醚甲環(huán)唑、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和氟啶脲回收率下降到70%以下，這可能由于LMWCNTs易吸附含有苯環(huán)平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥造成的[21]。此外，雖然5mg或者10mg吸附劑某些化合物獲得了更好的回收率，但凈化能力不如15mg，使用時(shí)有更多的色譜干擾。在LMWCNTs用量為15mg時(shí)，回收率也可以接受。因此，使用15mg(3mL提取物)作為凈化劑的最佳量。吸附劑用量對(duì)回收率的影響見圖2所示。

圖2 吸附劑用量對(duì)26種目標(biāo)化合物回收率的影響

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

為使26種化合物同時(shí)測(cè)定時(shí)定量結(jié)果更加準(zhǔn)確，日常檢測(cè)中使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量，各化合物的基質(zhì)效應(yīng)值見表2。

表2 26種目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)(ME)、線性方程、R2、LOD和LOQ

基質(zhì)效應(yīng)干擾目標(biāo)化合物的電離，導(dǎo)致離子響應(yīng)值增強(qiáng)或抑制，這對(duì)定量結(jié)果起著重要作用。為了確定基質(zhì)效應(yīng)，我們將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值(ME)作為評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)的大小，其中值在0.9～1.0表示基質(zhì)效應(yīng)較小可忽略不計(jì)，值小于0.9時(shí)，為基質(zhì)抑制效應(yīng)，值大于1.1時(shí)，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[22]。當(dāng)使用15mg的LMWCNTs凈化基質(zhì)時(shí)，只有6種物質(zhì)不受基質(zhì)效應(yīng)影響，3種物質(zhì)氟蟲腈、氟甲腈和氟蟲腈硫脒表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，特別是氟蟲腈和氟蟲腈硫脒其值為1.63和1.41；除蟲脲、丙溴磷、氟啶脲、涕滅威、溴氰菊酯、乙拌磷表現(xiàn)為較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，其他9種物質(zhì)表現(xiàn)出相對(duì)較弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)，其值在0.8～0.9之間?；|(zhì)效應(yīng)可能與化合物電離方式有關(guān)，氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈硫脒和氟蟲腈砜為負(fù)離子掃描模式，表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)或不受基質(zhì)效應(yīng)影響，其他物質(zhì)為正離子掃描模式，大部分物質(zhì)表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；其次，基質(zhì)效應(yīng)與目標(biāo)化合物分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，分子結(jié)構(gòu)中含有磷酸(-PO)、羥基(-OH)、偶氮(-N)、氨基(-R-NH-)、羧基(-COOH)、氨基甲酸酯(-O-CO-NH-)和尿素(-NH-CO-NH-)的化合物最容易受基質(zhì)效應(yīng)的影響[23]。同一類化合物的ME值非常接近，如嘧菌酯和吡唑醚菌酯、涕滅威砜和涕滅威亞砜。

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1 線性、定量限和檢出限

使用雞肉空白基質(zhì)提前液，配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.10μg/mL，通過(guò)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度響應(yīng)值，以待測(cè)物質(zhì)的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每種農(nóng)藥的測(cè)定系數(shù)(r2)的線性值。結(jié)果表明r2值皆大于0.99，表明25種藥物均在在0.005～0.1μg/mL和乙拌磷0.025～0.5μg/mL在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在實(shí)際測(cè)定中，如超出該范圍，可進(jìn)行適當(dāng)稀釋或濃縮。

為計(jì)算該方法的檢出限(LODs)和定量限(LOQs)，配制26種化合物系列濃度的單一基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種化合物每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行，然后以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限和10倍信噪比(S/N)計(jì)算定量限，各化合物的檢出限和定量限見表2。由表2可知：其中乙拌磷和溴氰菊酯的檢出限和定量限相對(duì)較高，但乙拌磷在食品中最大限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，乙拌磷及其氧化物和硫醇化合物總和以乙拌磷計(jì)，溴氰菊酯在國(guó)內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)中，最低殘留限量為0.01mg/kg，所以該方法能很好的滿足國(guó)內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.5.2 準(zhǔn)確度和精密度

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，對(duì)陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，為考慮26種物質(zhì)的同時(shí)添加，所以添加濃度選擇0.01mg/kg、0.02mg/kg和0.1mg/kg，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定8次，計(jì)算各化合物的回收率和精密度。所有農(nóng)藥的回收率均在70.9%～106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)均低于1.3%～11.4%。說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，可以滿足雞肉中26種藥物同時(shí)檢測(cè)的要求。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

從報(bào)檢的20份雞肉樣品中，測(cè)定26種化合物，其中一份檢出涕滅威亞砜9.0μg/kg，一份檢出溴氰菊酯15.0μg/kg，但都沒(méi)有超出國(guó)內(nèi)外殘留限量的要求。

3 結(jié)論

采用LMWCNTs凈化技術(shù)，聯(lián)合超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法，建立了雞肉中26種農(nóng)藥化合物殘留量的檢測(cè)方法。通過(guò)進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，證明各組分基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.005～0.1μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率均在70.9%～106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于或等于11.4%。因此，本方法用于雞肉中26種農(nóng)藥化合物殘留的檢測(cè)，具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、吸附劑用量少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，用于日常批量檢測(cè)可大大降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)速度，解決檢測(cè)雞肉樣品時(shí)易出現(xiàn)的干擾問(wèn)題，滿足當(dāng)前國(guó)內(nèi)外不斷更新的雞肉中26種農(nóng)藥殘留限量的標(biāo)準(zhǔn)要求。