近紅外法與濕化學(xué)法對(duì)奶牛不同飼喂階段TMR質(zhì)量檢測相關(guān)性分析

周春元 趙欣雅 周娟 馮晉芳 白鴻雁 姬翠英

摘? ? 要：通過對(duì)近紅外法與濕化學(xué)法的比較，對(duì)濕化學(xué)法測定奶牛TMR日糧的營養(yǎng)成分過程中暴露的問題進(jìn)行分析和總結(jié)，并矯正近紅外法測定的結(jié)果，最終指導(dǎo)奶牛TMR日糧的配制。取3個(gè)養(yǎng)殖水平相近的不同牧場的前期、中期、后期、干奶期4個(gè)不同飼養(yǎng)階段的奶牛TMR，采用2種方法對(duì)奶牛4個(gè)時(shí)期TMR的水分、干物質(zhì)、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、鈣和磷9項(xiàng)營養(yǎng)指標(biāo)進(jìn)行檢測，驗(yàn)證濕化學(xué)法和近紅外法的相關(guān)性。結(jié)果表明：用濕化學(xué)法與近紅外法測定的水分、干物質(zhì)、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、鈣和磷絕大多數(shù)有顯著差異（P<0.05），且水分、干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維呈強(qiáng)相關(guān)，灰分和磷呈弱相關(guān)，脂肪和鈣相關(guān)性不穩(wěn)定。對(duì)呈強(qiáng)相關(guān)的指標(biāo)構(gòu)建了相應(yīng)的回歸方程以校正近紅外法測定的結(jié)果。結(jié)果提示，構(gòu)建的回歸方程可直接矯正FOSS多功能近紅外分析儀（丹麥FOSS公司）。

關(guān)鍵詞：近紅外法;濕化學(xué)法;全混合日糧;相關(guān)性分析;回歸分析

中圖分類號(hào)：O657.33; S858.23? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.06.010

Correlation Analysis of Near Infrared and Wet Chemical Methods for TMR Quality Detection of Dairy Cows at Different Feeding Stages

ZHOU Chunyuan1， ZHAO Xinya2， ZHOU Juan1， FENG Jinfang1， BAI Hongyan1， JI Cuiying1

（1. Tianjin Jialihe Feed Company Limited， Tianjin 301800， China; 2. Key Laboratory for Animal Breeding and Healthy Breeding， School of Animal Science and Zoology， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： The purpose of this study was to analyze and summarize the problems exposed in the process of wet chemical method determination of nutrients in dairy cows' TMR diet by comparing NIR method with wet chemical method， and correct the results obtained by NIR method， so as to finally guide the formulation of dairy cows' TMR diet. Dairy cows TMR were taken from three different pastures with similar breeding levels at four different feeding stages （early， middle， late， and dry milk stage）. Four periods of cows stage of total mixed diet of MC， DM， CA， CP， CF， NDF， ADF， Ca and P and other 9 nutrition indicators respectively by wet chemical method and the near infrared method for testing and verify whether the wet chemical method and the near infrared method. The results showed that the MC， DM， CA， CP， CF， NDF， ADF， Ca and P measured by wet chemical method and near infrared method was significantly different（P<0.05）. The correlation between MC， DM， CP， NDF and ADF was strong， the correlation between CA and P was weak， and the correlation between CF and Ca was unstable. Regression analysis was carried out and regression equation was constructed. Therefore， the established regression equation can directly correct the FOSS multifunctional near infrared analyzer （FOSS， Denmark）.

Key words： NIR; wet chemical method; TMR; correlation analysis; regression

近年來，我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展規(guī)模逐步擴(kuò)大，對(duì)飼料的需求日益旺盛，為了提高奶牛的采食量和飼料轉(zhuǎn)化率，使飼料配方更加科學(xué)高效，各大牧場和飼料加工企業(yè)對(duì)全混合日糧（total mixed ration， TMR）技術(shù)已經(jīng)全面應(yīng)用[1]。TMR可提高奶牛產(chǎn)奶量、奶牛采食量、奶牛繁殖率，降低奶牛疾病發(fā)生率[2]。只有準(zhǔn)確地測定TMR的成分，才能保證滿足奶牛各個(gè)時(shí)期的營養(yǎng)需求。但是，傳統(tǒng)濕化學(xué)法不但會(huì)破壞樣品內(nèi)含有的常規(guī)養(yǎng)分，而且檢測過程緩慢，方法復(fù)雜。因此，生產(chǎn)中飼料質(zhì)量控制及其營養(yǎng)成分的快速分析顯得越來越重要。近紅外分析法（near infrared reflectance spectroscopy， NIRS）是一種間接分析技術(shù)，在操作過程中樣品制備簡單，不耗費(fèi)化學(xué)藥品，可及時(shí)指導(dǎo)奶牛TMR日糧的配制[3-5]。近紅外分析法在我國的應(yīng)用起步較晚，20世紀(jì)90年代才開始進(jìn)行相關(guān)研究。在這個(gè)過程中，由于受到很多因素的影響，相關(guān)基礎(chǔ)研究工作及數(shù)據(jù)庫的建設(shè)與發(fā)達(dá)國家相比進(jìn)展較慢，飼料常規(guī)成分的定標(biāo)軟件也沒有及時(shí)推出，因此導(dǎo)致飼料常規(guī)成分分析工作效率較低，應(yīng)用的難度較大[6]。Mentink等[7]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)很好地分析了奶牛 TMR 中粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、淀粉（Starch）、NFC 及粗脂肪等成分含量。但鮮有文獻(xiàn)報(bào)道用近紅外法與濕化學(xué)法對(duì)奶牛不同飼喂階段TMR 質(zhì)量進(jìn)行相關(guān)性分析。因此，本研究對(duì)濕化學(xué)法和近紅外法進(jìn)行營養(yǎng)分析的差異性比較和相關(guān)性分析，得出近紅外法對(duì)奶牛各個(gè)時(shí)期TMR日糧的各個(gè)營養(yǎng)指標(biāo)的回歸方程。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年3月初，在天津市嘉立荷牧業(yè)集團(tuán)有限公司管理的3個(gè)養(yǎng)殖水平相近的牧場，選擇有代表性的前期、中期、后期、干奶期4個(gè)不同飼養(yǎng)階段的奶牛TMR樣品共 47份。其中，前期樣品11份，中期樣品12份，后期樣品12份，干奶期樣品12份。

1.2 試驗(yàn)藥品

氫氧化鈉：AR，95%（天津百奧泰科技發(fā)展有限公司）;乙二胺四乙酸二鈉：AR（天津百奧泰科技發(fā)展有限公司）;四硼酸鈉：AR（天津百奧泰科技發(fā)展有限公司）;草酸銨：AR（天津百奧泰科技發(fā)展有限公司）;偏釩酸銨：99.9% metals basis（天津百奧泰科技發(fā)展有限公司）;十二烷基硫酸鈉：AR，92.5%～100.5%（天津弘鋒偉利科技發(fā)展有限公司）;十六烷三甲基溴化銨：AR（西安瑞麗潔實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;鉬酸銨：99%（北京伊諾凱科技有限公司）;磷酸二氫鉀：99%（上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用四分法將每個(gè)樣品縮分至0.5 kg左右，用烘箱干燥（65 ℃，48 h）后，用粉碎機(jī)粉碎過40目篩。每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣進(jìn)行測定，分別用常規(guī)使用的濕化學(xué)法和近紅外法進(jìn)行測定，然后將2種方法的測試結(jié)果進(jìn)行比較分析。分別利用濕化學(xué)法和近紅外法測定奶牛TMR樣品中的總水分、干物質(zhì)（DM）、粗灰分、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、鈣和磷的含量。結(jié)果以干物質(zhì)基礎(chǔ)計(jì)算。

1.4 主要儀器

多功能近紅外分析儀，凱氏定氮儀，全自動(dòng)索氏浸提儀，全自動(dòng)纖維分析儀均購自丹麥FOSS公司;馬弗爐，購自天津瑪福爾科技有限公司;烘箱，購自蘇州同福烘箱制造有限公司;紫外分光光度計(jì)，購自北京能克工程有限共公司。

1.5 奶牛TMR的NIRS測定

采用FOSS多功能近紅外分析儀NIRS DS 2500，用鹵鎢燈作為儀器光源，使用硫化鉛探測器，譜區(qū)范圍在1 100～2 500 nm。2 nm的光譜間隔，掃描32次。利用來自天津嘉立荷牧業(yè)集團(tuán)飼料公司的近紅外快速檢測模型，取與濕化學(xué)法測定等質(zhì)量的樣品，放入分析儀的檢測盒中進(jìn)行光譜掃描，獲得樣品中的總水分、DM、粗灰分、CP、EE、NDF、ADF、鈣和磷的含量[8-9]。

1.6 奶牛TMR的濕化學(xué)法測定

1.6.1 總水分測定方法 用蒸餾水洗凈搪瓷盤，在60～70 ℃烘箱中烘干1 h。取出搪瓷盤，在室溫冷卻，用普通天平稱質(zhì)量。稱取適量鮮樣，用電子天平稱質(zhì)量。在120 ℃烘箱中滅活15～20 min，再降至60～70 ℃干燥12 h，取出后，在室溫中回潮24 h，用普通天平稱質(zhì)量。重復(fù)上述操作，直到2次稱質(zhì)量之差低于0.5 g為止，稱出烘干后的樣品和搪瓷盤的總質(zhì)量。

1.6.2 DM測定方法 DM含量參照GB/T 6435—2014方法測定。

1.6.3 粗灰分測定方法 將洗凈的坩堝放置于550 ℃馬弗爐中灼燒30 min，斷電降溫至200 ℃左右，放入干燥器中冷卻30 min，用0.5%的氯化鐵墨水溶液編號(hào)，稱其質(zhì)量。重復(fù)試驗(yàn)，直至2次質(zhì)量之差小于0.000 5 g。稱取樣品2 g于坩堝中，每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣進(jìn)行測定，放在電爐上小心炭化至無煙。將樣品炭化完全的坩堝移入馬弗爐，升溫至550 ℃，灼燒3 h。灼燒結(jié)束后，等待馬弗爐降至室溫，取出后在空氣中冷卻1 min，將坩堝移入干燥器冷卻至室溫后稱質(zhì)量。灼燒1 h，冷卻后稱質(zhì)量，直至2次質(zhì)量之差小于0.000 1 g。

1.6.4 CP測定方法 CP含量參照 GB/T 6432—2018方法測定。

1.6.5 EE測定方法 將干凈鋁瓶105 ℃烘干30 min（或洗凈的鋁瓶烘2 h），放入干燥器中冷卻，稱質(zhì)量。重復(fù)試驗(yàn)直至2次質(zhì)量之差小于0.000 5 g。稱取2 g左右樣品放入濾紙筒烘干，準(zhǔn)確至0.000 2 g。將盛有樣品的濾紙筒和鋁瓶放入全自動(dòng)脂肪分析儀中。將連接器連接上石油醚，排空。轉(zhuǎn)動(dòng)到第一個(gè)樣本90 mL石油醚，其他的為85 mL。結(jié)束后選擇菜單中浸提，按恢復(fù)按鈕。等待顯示器上時(shí)間倒計(jì)時(shí)結(jié)束，回收乙醚。取出鋁瓶放入烘箱，烘干結(jié)束后放入干燥器冷卻稱質(zhì)量。

1.6.6 NDF測定方法 將0.5 g左右的樣品放入已知質(zhì)量的F57 濾袋中，用封口機(jī)封口，每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣測定。樣品架每批可放24個(gè)濾袋，分8層，每層放置3個(gè)。將樣品架置于纖維分析儀中，加入4 mL淀粉酶，密封，設(shè)定好時(shí)間。在左側(cè)加液杯中加入250 mL（含8 mL淀粉酶）水溶液，調(diào)開關(guān)到NDF選項(xiàng)，儀器開始運(yùn)行。2 h左右取出樣品架，用蒸餾水沖洗濾袋，然后取適量的丙酮放在 250 mL 燒杯中，將濾袋放入燒杯中浸泡3～4 min。取出濾袋擠凈丙酮，將濾袋放在搪瓷盤中，在通風(fēng)櫥晾干至無味。待丙酮完全揮發(fā)后，將放有濾袋的搪瓷盤放在105 ℃烘箱中烘干。取出樣品，放于干燥器內(nèi)，降至室溫后稱質(zhì)量。

1.6.7 ADF測定方法 將測完NDF烘干后的濾袋，放在樣品架上，每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣進(jìn)行測定，樣品架每批放24個(gè)濾袋，分8層，每層放3個(gè)。將樣品架放置于纖維分析儀中，密封，設(shè)定好時(shí)間，調(diào)開關(guān)到ADF選項(xiàng)，儀器開始運(yùn)行。2 h左右取出樣品架，用蒸餾水沖洗濾袋，然后取適量丙酮放在燒杯中，將濾袋放入燒杯，浸泡3～4 min。取出濾袋擠凈丙酮，將濾袋放在搪瓷盤中，在通風(fēng)櫥晾干至無味。待丙酮揮發(fā)完全后，將放有濾袋的搪瓷盤放在105 ℃烘箱中烘干。取出樣品，置于干燥器中降溫至室溫，再稱質(zhì)量[10-11]。

1.6.8 鈣測定方法 向已燒好灰分的坩堝中加入1∶3鹽酸溶液10 mL和濃硝酸溶液幾滴，小心煮沸，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，并用蒸餾水沖洗坩堝和漏斗濾紙，冷卻至室溫定容，搖勻，即為分解液。用移液管準(zhǔn)確取樣品10 mL放到250 mL燒杯中，加水100 mL，加甲基紅指示劑2滴，再加入1∶1的氨水溶液直到變橙色，然后煮沸。如果出現(xiàn)絮狀沉淀，需過濾4～5次至另一個(gè)錐形瓶中;再次滴加10%醋酸溶液直到溶液變紅，小心煮沸，慢慢滴加草酸銨溶液10 mL，期間不斷地?cái)嚢?，如果溶液由紅變成橙色，再繼續(xù)滴加10%醋酸溶液至紅色，煮沸幾分鐘后，放在水浴鍋上加熱2 h。用1∶50氨水溶液洗滌沉淀6～8次，再加幾滴1∶3的硫酸溶液至2～3 mL的接收濾液瓶中，加熱到80 ℃，再加高錳酸鉀溶液1滴，溶液呈微紅色，保持30 s不褪色即完成過濾。將沉淀和濾紙轉(zhuǎn)移到原燒杯中，加入1∶3的硫酸溶液10 mL，蒸餾水50 mL，加熱至80 ℃，用高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到微紅色，保持30 s不褪色即為終點(diǎn)。

1.6.9 磷測定方法 向盛有灰分的坩堝中加入1∶3鹽酸溶液10 mL和濃硝酸溶液幾滴，小心煮沸，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，并用蒸餾水沖洗坩堝和漏斗濾紙，冷卻至室溫定容，搖勻，即為分解液。分別準(zhǔn)確移取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1.0，2.0，5.0，10.0，15.0 mL于6個(gè)50 mL容量瓶中，再加入釩鉬酸銨顯色試劑10 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。用0 mL溶液做參比，用10 mm比色皿，在400 nm波長下，用分光光度計(jì)測定溶液吸光度，以每個(gè)容量瓶中的磷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取試樣分解液5 mL在50 mL容量瓶中，再加入10 mL釩鉬酸銨顯色試劑，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。用空白做參比，用10 mm比色皿，在400 nm波長下，用分光光度計(jì)測定溶液吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查分解液含磷量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理與分析采用 SPSS 21.0 程序進(jìn)行，對(duì)2種方法所測定的試驗(yàn)指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、LSD法多重比較和典型相關(guān)性分析，并做線性相關(guān)，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕化學(xué)法和NIRS測定的差異性分析

由表1—4可知，對(duì)濕化學(xué)法與NIRS測定的奶牛TMR的總水分、DM、粗灰分、CP、EE、NDF、ADF、鈣和磷的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，其P 值大部分小于0.05，個(gè)別大于0.05。由于常規(guī)濕化學(xué)法是公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，因此在利用NIRS測定這些飼料樣品中的相關(guān)營養(yǎng)成分時(shí)應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)校正。

2.2 濕化學(xué)法和NIRS測定的相關(guān)性分析

由表5可知， 濕化學(xué)法與NIRS測定的DM、粗灰分、CP、EE、NDF、ADF、鈣 和 磷 的R值均在0～1之間，表明測定營養(yǎng)成分的2種方法成正相關(guān)，且總水分、DM、CP、NDF、ADF呈強(qiáng)相關(guān)，灰分和磷呈弱相關(guān)，EE和鈣相關(guān)性不穩(wěn)定;P值絕大部分小于0.05，表明利用2種分析方法測定的TMR樣品中的各營養(yǎng)成分有顯著差異。但要注意，在測定TMR樣品中的磷含量時(shí)，P值大于0.05，表明利用2種分析方法測定的TMR樣品中的磷無顯著差異（P>0.05）。

2.3 構(gòu)建回歸方程

由上述相關(guān)性分析結(jié)果可知，總水分、DM、CP、NDF、ADF呈強(qiáng)相關(guān)，對(duì)此，筆者進(jìn)行了回歸分析，并建立了濕化學(xué)法到近紅外法的線性回歸方程?；貧w方程如表6—9。方程可用來校正NIRS測定的結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)呈強(qiáng)相關(guān)的指標(biāo)構(gòu)建了相應(yīng)的回歸方程以校正近紅外法測定的結(jié)果，構(gòu)建的回歸方程可直接矯正FOSS多功能近紅外分析儀（丹麥FOSS公司）分析出的總水分、DM、CP、NDF、ADF的含量。

通過對(duì)2種測定方法的比較，對(duì)濕化學(xué)法測定過程中暴露的問題進(jìn)行全面的分析和總結(jié)，并對(duì)近紅外法進(jìn)行分析校正，為指導(dǎo)奶牛TMR日糧的配制及質(zhì)量快速評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。

3.2 討論

3.2.1 濕化學(xué)法和近紅外法測定的差異性分析? 劉溫等[12]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)與常規(guī)方法檢測紫花苜蓿品質(zhì)并進(jìn)行對(duì)比研究，2種方法差異不顯著。但本研究測定奶牛TMR結(jié)果差異顯著，結(jié)果差異性不同可能是因?yàn)椴煌暳掀贩N對(duì)測定結(jié)果有影響[13]。

3.2.2 濕化學(xué)法和近紅外法測定的相關(guān)性分析? 曹明月等[14]進(jìn)行了近紅外法快速檢測TMR日糧常規(guī)營養(yǎng)成分含量的研究，初步建立TMR的近紅外光譜預(yù)測模型，可精準(zhǔn)預(yù)測DM、CP、NDF、ADF等4個(gè)指標(biāo)的含量，但只能粗略估測出EE含量。Mentink等[7]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)很好地分析了奶牛 TMR 中CP、NDF、Starch、NFC 及EE等成分含量。本研究用2種方法測定的EE相關(guān)性較差，與曹明月等[14]測定的一致，只能粗略估測。

Samadi等[15]做了NIRS數(shù)據(jù)分析快速和同時(shí)預(yù)測飼料營養(yǎng)參數(shù)的研究，還做了利用近紅外反射光譜快速同時(shí)預(yù)測動(dòng)物飼料的營養(yǎng)價(jià)值的研究，得出近紅外法與常規(guī)化學(xué)法測定樣品中總水分含量存在極顯著差異，不能準(zhǔn)確測定[16-17]。而本研究通過大量數(shù)據(jù)得出，用2種方法測定的水分呈強(qiáng)相關(guān)，可通過回歸方程得出水分的準(zhǔn)確的含量。造成2種試驗(yàn)結(jié)果不同的原因可能是數(shù)據(jù)太少，這需要進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

3.2.3 構(gòu)建回歸方程 在利用NIRS分析飼料營養(yǎng)成分時(shí)，應(yīng)根據(jù)奶牛不同階段的TMR日糧進(jìn)行調(diào)整回歸方程和預(yù)測模型，才能使檢測結(jié)果更加精準(zhǔn)。另外，近紅外法測定結(jié)果還可能受儀器的狀態(tài)影響，不同型號(hào)的儀器測定結(jié)果也可能不同。

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