楊利超 ,郭鑾英 ,王妮娜 ,馬 駿 ,李國慧 ,陳守義 ,劉 全

鉤端螺旋體病(Leptospirosis)是一種由螺旋體目(Spirochaetales)螺旋體科(Leptospiraceae)鉤端螺旋體屬(Leptospira)的致病性鉤端螺旋體引起的人獸共患疾病。鉤端螺旋體種類較多,目前已發(fā)現(xiàn)有23種,共有10種對人和動物致病[1]。我國發(fā)現(xiàn)有問號鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)、博氏鉤端螺旋體(L.borgpetersenii)、圣地羅西鉤端螺旋體(L.santarosai)和韋氏鉤端螺旋體(L.weilii)4種[11],其中廣東主要流行問號鉤端螺旋體(L.interrogans)。鉤端螺旋體可感染多種宿主,主要有鼠類動物(黑線姬鼠、黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠等)和家畜(豬、犬和牛等)[2],其中鼠類與人生存環(huán)境接近,人接觸被鼠類污染的水和土壤后通過受損皮膚或者粘膜而感染鉤端螺旋體,臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、發(fā)冷等癥狀,更嚴(yán)重者會出現(xiàn)肝損傷和黃疸、腎功能衰竭和內(nèi)出血等嚴(yán)重后果,進(jìn)而導(dǎo)致死亡[3]。

鉤端螺旋體病主要在熱帶和亞熱帶國家流行[4],屬于全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的重要人獸共患傳染病[5]。根據(jù)我國傳染病防治法,鉤端螺旋體病屬于乙類傳染病。早在1934年,中國廣東省就報(bào)告了首例人鉤端螺旋體病[6],到目前我國有29個省份曾報(bào)道該病流行,在1955年至2016年間我國共出現(xiàn)了10次鉤端螺旋體病發(fā)病率超過10/10萬的特大流行[7],共造成超過254萬人感染該病,其中有2萬多人死亡[8]。

廣州市地處亞熱帶沿海地區(qū),溫?zé)岫嘤?鼠類動物種類繁多,與人類接觸密切,這增加了鉤端螺旋體病等鼠類動物疾病在該地區(qū)傳播的風(fēng)險[9],因此,有必要了解宿主動物的流行情況。近年來,尚無文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道使用PCR 技術(shù)對廣州市鼠類動物感染鉤端螺旋體流行情況的監(jiān)測。因此,本研究調(diào)查了廣州市鼠類動物中致病性鉤端螺旋體病的流行情況和遺傳特征,為廣州市鉤端螺旋體病的預(yù)防與控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 本實(shí)驗(yàn)室2018－2019年在廣州市花都區(qū)、海珠區(qū)和從化區(qū)采用籠捕法捕捉鼠類動物共200只。所有動物均在24 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室并在生物安全柜內(nèi)解剖,采集脾臟,置入無菌無酶EP管中,置于－80 ℃冰箱保存待用。

1.2 總DNA 的提取 無菌無酶EP管中取樣本約5 g,加入400μL 4 ℃預(yù)冷的DMEM 培養(yǎng)液,使用組織研磨儀(Qiagen),72 Hz研磨3 min后,12 000 r/min 4 ℃離心10 min,取上清液250μL,使用DNA 提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司),提取組織中的DNA。實(shí)驗(yàn)操作過程根據(jù)試劑盒說明書的流程進(jìn)行,最終獲得DNA 共50μL 置于－80 ℃待用。

1.3 巢式PCR 擴(kuò)增和測序 參考文獻(xiàn)報(bào)道的鉤端螺旋體16SrRNA和LipL32基因引物[10],對提取的總DNA 用巢式PCR 進(jìn)行細(xì)菌序列擴(kuò)增。反應(yīng)第1輪擴(kuò)增體系10μL:Ex Taq 0.15μL(TaKaRa公司),10×Ex Taq Buffer 1μL,d NTP Mixture 0.8 μL,上下游引物各0.4μL(10μmol/L),模板1μL,補(bǔ)充雙蒸餾水至10μL。第2 輪擴(kuò)增體系50μL:Ex Taq 0.25μL(Ta KaRa公司),10×Ex Taq Buffer 5μL,d NTP Mixture 4μL,上下游引物各2μL(10μmol/L),模板1μL,補(bǔ)充雙蒸餾水至50μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,退火(溫度見表1)30 s,72℃延伸(時間見表1),35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DUT-48藍(lán)光切膠儀檢測,陰性對照模板使用無核苷酸酶雙蒸水代替,選擇條帶大約在1 230 bp和730 bp的特異性條帶,送到廣州天一輝遠(yuǎn)公司測序。具體引物信息和擴(kuò)增條件見表1。

表1 PCR 引物和擴(kuò)增條件Tab.1 PCR primers and amplification conditions

1.4 序列分析與比對構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 將獲得的測序結(jié)果,在NCBI-BLAST 上進(jìn)行序列比對鑒定,確定獲得核酸序列屬于目的序列。使用軟件Mega7.0對獲得的序列進(jìn)行比對和處理,采用鄰接法(Neighbor joining method,NJ)基于Kimura-2-Parameter(K2P)模型,Bootstrap test 1 000 次,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 樣品采集情況 在廣州市3個區(qū)采集到5種鼠類動物共200只。其中花都區(qū)褐家鼠100只;從化區(qū)褐家鼠20只、臭鼩鼱22只、板齒鼠4只、黃胸鼠3只、黃毛鼠1只;海珠區(qū)褐家鼠50只(圖1)。

圖1 廣州市樣品采集地點(diǎn)Fig.1 Map of Guangzhou showing locations of sample collection

2.2 PCR 檢測結(jié)果 在200份樣品中共檢出3份鉤端螺旋體陽性樣本,編號分別為HDSP52、64、72,16SrRNA基因和LipL32 基因檢測率一致,總陽性率為1.5%?；ǘ紖^(qū)褐家鼠中檢出陽性3 份(3.0%),從化區(qū)和海珠區(qū)均為陰性(表2)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖電泳見明顯1 230 bp和730 bp的目標(biāo)條帶,與預(yù)期大小一致(圖2)。

圖2 褐家鼠中鉤端螺旋體巢式PCR 結(jié)果Fig.2 Nested PCR results for Leptospira in Rattus norvegicus

表2 樣品采集與檢測情況Tab.2 Sample collection and testing

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 經(jīng)Meg Align軟件同源性分析,本研究擴(kuò)增獲得3 條16SrRNA和LipL32基因陽性樣本序列之間的同源性分別為99.3%～99.6%和97.7%～99.2%。將測序獲得符合質(zhì)量的序列,在NCBI-BLAST 進(jìn)行同源性比對,與Gen-Bank中獲得的10 種致病性鉤端螺旋體的16S rRNA基因和9種致病性鉤端螺旋體的LipL32基因序列進(jìn)行比對,比對結(jié)果截齊后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖3所示,陽性樣本HDSP52、64、72與致病性問號鉤端螺旋體(L.interrogans)菌株在同一個分支內(nèi),與L.interrogans(MT645311.1、LC459958.1)親 緣關(guān)系最近,序列同源性大于99%。圖4所示,陽性樣本HDSP52、64、72 與致病性問號鉤端螺旋(L.interrogans)菌株在同一個分支內(nèi),與L.interrogans(EU871718.1、AY461906.1)親緣關(guān)系最近,序列同源性為99%。

圖3 基于10種致病性鉤端螺旋體16S rRNA 部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA partial sequences of ten pathogenic Leptospira

圖4 基于9種致病性鉤端螺旋體Lip L 32部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on Lip L 32 partial sequences of ten pathogenic Leptospira

3 討論

近年來我國在鉤端螺旋體病的預(yù)防、控制方面取得了較大的進(jìn)步,鉤端螺旋體病在人群中發(fā)病率和死亡率逐年下降。然而,由于致病性鉤端螺旋體可感染多種動物宿主[11],其流行后會在疫區(qū)野生動物中長期存在,我國每年都有人因鉤端螺旋體病而死亡,因此鉤端螺旋體病仍是我國重要的人獸共患傳染病。

鼠類動物是多種病原體的宿主,同時也是與人類接觸最多的動物之一[12]。隨著經(jīng)濟(jì)、旅游和商業(yè)開發(fā)等的發(fā)展,使鼠類動物原有的生態(tài)環(huán)境遭到改變,造成鼠類動物遷徙、流竄[13]。當(dāng)宿主動物感染鉤端螺旋體后,受感染的動物可通過尿液排菌,從而污染土壤,而頻繁的降雨會將鉤端螺旋體污染的土壤沖入水體,增加人通過接觸被鉤端螺旋體污染的水或土壤而感染鉤端螺旋體的概率[14]。廣州市是一個人口密集,降雨頻繁且水網(wǎng)密布的地區(qū),也是鉤端螺旋體病多發(fā)的地區(qū)。對廣州地區(qū)鼠類動物中鉤端螺旋體病的情況進(jìn)行監(jiān)測,對了解當(dāng)?shù)劂^端螺旋體在宿主中的流行情況,并有針對性地做好預(yù)防與控制,防止鉤端螺旋體病在廣州傳播有重要作用。

近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,特別是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法,具有高敏感性、檢測準(zhǔn)確性、成本低和效果好等特點(diǎn),因此廣泛用于鉤端螺旋體的監(jiān)測。2015年胡群等[15]通過PCR 技術(shù)對寧波梅山口岸72只鼠類腎組織進(jìn)行鉤端螺旋體檢測,發(fā)現(xiàn)在黑線姬鼠中陽性率為6.9%;張翠彩等[16]通過暗視野顯微凝集試驗(yàn)(檢測抗體)和MLST 技術(shù)對2016－2018年捕捉的江西省1 404只鼠類動物進(jìn)行鉤端螺旋體檢測,在黑線姬鼠和黃毛鼠中檢測到,陽性率為4.6%。而在本研究中,褐家鼠中鉤端螺旋體陽性率是1.5%,這由于鉤端螺旋體的宿主特異性和地域的不同,在Dhewantara等[17]的研究調(diào)查中顯示,寧波、江西省屬于高發(fā)地區(qū),廣東屬于發(fā)病中等地區(qū),這與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致;2005年許曉茵等[18]對廣州市番禺區(qū)鼠類動物進(jìn)行鉤端螺旋體血清凝集溶解試驗(yàn)(檢測抗體),鼠類陽性率為32.5%;2011年孫小康等[19]在廣東省清遠(yuǎn)市對鼠類動物進(jìn)行鉤端螺旋體暗視野顯微凝集試驗(yàn)(檢測抗體),在板齒鼠、黃毛鼠、臭鼩鼱、褐家鼠和黃胸鼠檢測到,陽性率為22.3%。本研究結(jié)果比廣州市番禺區(qū)、清遠(yuǎn)市報(bào)道的感染率低,這可能與本研究的檢測方法、檢測組織有關(guān),且與黑線姬鼠是鉤端螺旋體的優(yōu)勢鼠種有關(guān),而本研究中的鼠類主要是褐家鼠。與之前的研究相比,本研究使用PCR 技術(shù)進(jìn)行檢測,可較為直接的反映廣州市鼠類動物中鉤端螺旋體的流行情況。

脾臟作為機(jī)體重要的淋巴器官,在機(jī)體免疫鉤端螺旋體的過程中發(fā)揮著重要作用。鉤端螺旋體感染宿主動物,經(jīng)過潛伏期后,在血液中大量繁殖,進(jìn)而迅速擴(kuò)散到機(jī)體的組織器官[20],但在不同組織器官的選擇適應(yīng)性有很大差異。在腎臟中鉤端螺旋體受機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響較小,故尿中可長時間排菌[21]。遺憾的是,本次研究的樣本只獲得了脾臟,不能分析在同一只鼠類動物不同器官鉤端螺旋體分布的差異。

本研究是首次在廣州地區(qū)使用PCR 技術(shù)對鼠類動物進(jìn)行鉤端螺旋體流行情況檢測,在花都區(qū)褐家鼠中鑒定出3株致病性問號鉤端螺旋體(L.interrogans)。在鼠類動物中進(jìn)行鉤端螺旋體病流行情況的監(jiān)測有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義,本研究為廣州市鉤端螺旋體病的預(yù)防與控制提供參考依據(jù)。

利益沖突:無

引用本文格式:楊利超,郭鑾英,王妮娜,等.廣州市鼠類動物鉤端螺旋體的感染調(diào)查[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(6):473-477.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.055