淺析鉤端螺旋體菌種的長期保存

徐穎華,葉 強(qiáng),徐 苗

鉤端螺旋體病(簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)引起的一種急性人獸共患傳染病[1]。隨著全球氣候愈發(fā)變暖以及日益城市化引起了鉤體的動物宿主環(huán)境改變,即便是在一些經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的歐美國家,報道的鉤體病例數(shù)也呈現(xiàn)增多的趨勢[1-2],因此鉤體病預(yù)防和控制已引起各級公共衛(wèi)生管理部門重視。

鉤體病原體的種群豐富、多樣性,至今,已在世界不同國家和地區(qū)共報道了近30種血清群300多種不同血清型鉤體,且仍不斷有新的血清型鉤體被報道[3]。為了更好監(jiān)測鉤體血清群(型)的流行趨勢變化,研究人員根據(jù)世界上不同國家和區(qū)域主要流行菌群選擇了24群代表株用于鉤體血清群的分類檢測。而中國為鉤體菌種資源最豐富的國家,從不同時期數(shù)千株流行血清群中選擇出15群代表株,并以此篩選出76個血清型代表株,其中大部分菌株也是我國鉤體滅活疫苗的生產(chǎn)用菌株或檢定用菌種,這些代表性菌種是鉤體流行病監(jiān)測和疫苗生產(chǎn)最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[4]。由于鉤體的培養(yǎng)和生長特性,目前仍沒有成功解決鉤體凍干保存方法,如何長期、有效保存鉤體一直困擾著從業(yè)人員。為更好了解鉤體的長期保存鉤體方法,本文將就鉤體在不同環(huán)境的存活能力、各種不同保存鉤體方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及面臨的問題與挑戰(zhàn)進(jìn)行綜述。

1 鉤端螺旋體在不同環(huán)境的存活能力

鉤體屬按照致病性可分為問號鉤體和腐生性鉤體,前者分離自病人和動物,具有寄生性;而后者通常對人或動物不致病,常見于環(huán)境土壤和水中[5]。盡管問號和腐生性鉤體在人工制備培養(yǎng)基上需要相類似的營養(yǎng)和溫度等條件才能生存,但研究發(fā)現(xiàn)腐生性鉤體在適宜的水環(huán)境中可以長期存活,而致病性鉤體在不同自然環(huán)境中存活能力也不盡相同,例如發(fā)現(xiàn)澳洲群鉤體可在30 ℃的稻田水存活7～14 d,但在42 ℃環(huán)境中僅能存活3 h[6],表明不同的致病特性決定了鉤體屬內(nèi)不同種在不同自然環(huán)境的存活能力,而環(huán)境因素也將影響鉤體的存活。事實上,大量研究發(fā)現(xiàn)了致病性鉤體主要與環(huán)境的溫濕度、pH 值以及生長所必需營養(yǎng)密切相關(guān)。例如鉤體在非常清潔的水中(例如泉水),或污染嚴(yán)重的水中,存活的時間都比較短。而在稻田水和荒棄池塘水的存活時間長[6-7]。此外,研究人員還發(fā)現(xiàn)鉤體可與其他微生物形成生物膜,被認(rèn)為與鉤體在自然環(huán)境中持久存在密切相關(guān)[8]。

2 室溫定期傳代保存

在日常教學(xué)和科研實驗活動中,通常將鉤體菌種保存在含兔血清的EMJH、磷酸鹽或其他適宜培養(yǎng)基中,放置室溫在18 ℃～20 ℃的干燥、通風(fēng)性好的暗櫥中,并定期(每隔1～3個月)傳代1次。當(dāng)前我們實驗室仍然采用這種方式長期保存菌種[4]。多年經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)這種方式可以長期保存鉤體菌種,且菌種仍具有良好的抗原反應(yīng)性。但也存在以下缺點(diǎn):1)經(jīng)反復(fù)傳代,菌株毒力和致病力大大降低;2)長期傳代,菌種的基因組發(fā)生一定遺傳變異;3)多次傳代增加了雜菌污染的風(fēng)險。4)需專人負(fù)責(zé)菌種、費(fèi)時費(fèi)力、成本較高。

為了克服上述需要定期傳代的問題,Wuthiekanun等[9]開發(fā)了一種簡單實用的保存鉤體方法,將100μL的濃度約為107CFU/mL 鉤體接種至含有5 mL 已高壓滅菌的Leptospira Vanaporn Wuthiekanun瓊脂培養(yǎng)基的小管中,擰緊后放置在25 ℃～30 ℃保存。100株致病性鉤體采用這種方法保存12個月后,發(fā)現(xiàn)所有菌株復(fù)蘇均可存活。這種培養(yǎng)基中主要含有3種核心成分,包括EMJH 培養(yǎng)基、瓊脂和兔血清。無需頻繁的傳代,減少了污染的風(fēng)險,且憑肉眼觀察便可判斷鉤體的生長能力。但由于保存12個月后觀察到瓊脂干燥,提示可能不適合長期保存菌種,也需要定期轉(zhuǎn)種。

3 低溫凍存

低溫冷凍是保存原核微生物最簡單有效方法之一,在低溫狀態(tài)下,微生物內(nèi)所有細(xì)胞和代謝活動停止,幾乎不影響微生物的生理和遺傳特性[10-12]。早在70年前,研究人員發(fā)現(xiàn)將鉤體放置－80 ℃冰箱中,大部分鉤體均可復(fù)蘇存活。然而應(yīng)用低溫冷凍原核微生物,在微生物體內(nèi)不可避免地發(fā)生結(jié)冰,引起其脫水和變性,影響微生物復(fù)蘇存活[12]。為了提高鉤體的低溫冰凍保存的存活率,研究人員探索添加不同保護(hù)劑和培養(yǎng)基,例如甘油、羊血和EMJH液體培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)常用的細(xì)菌凍存保護(hù)劑對于保存鉤體效果不明顯,而單獨(dú)用EMJH 液體培養(yǎng)基用于保存6種不同血清型鉤體,放置的－70 ℃冰凍后6、12和20個月后,復(fù)蘇均能成功存活[10]。

此外,研究證實低溫凍存時鉤體濃度可影響后續(xù)復(fù)蘇存活率。將濃度為(107～109)CFU/mL 鉤體感染的倉鼠腎臟冰凍后能成功復(fù)蘇鉤體,而鉤體濃度為103～104CFU/mL 感染的倉鼠腎臟則不能[11]。此外,Samir等發(fā)現(xiàn)將6種鉤體血清型濃度為3×108CFU/mL 的EMJH 液體培養(yǎng)基－70 ℃冰凍后20個月后,均100%復(fù)蘇存活[10]。這些研究結(jié)果提示合適培養(yǎng)基和凍存時鉤體濃度與低溫長期保存相關(guān)[12]。

4 液氮保存

研究人員應(yīng)用液氮保存鉤體菌種的探索性實驗研究,將用鉤體菌感染豚鼠后,抽取血液按1%量接種于含10%兔血清的Stuart培養(yǎng)基中,再加入10%無菌甘油保存于—168 ℃的液氮中,5 年后觀察中大部分菌株的運(yùn)動性和毒力未見明顯變化,但也發(fā)現(xiàn)液氮保存的103株中有9株未能獲得復(fù)蘇,建議可能由于微生物污染或凍存的菌種濃度偏低造成[13]。我們實驗室也曾將致病性和非致病性鉤體菌種進(jìn)行液氮深凍鉤體菌種的存活率和復(fù)蘇率進(jìn)行了觀察,366株菌種在深凍保存24個月后,存活復(fù)蘇率高達(dá)99%,表明含有10%兔血清的鉤體培養(yǎng)物可直接用于液氮保存[14]。

盡管很多鉤體實驗室建議使用液氮冷凍來長期保存鉤體菌株,但使用的培養(yǎng)基、保護(hù)劑以及具體冷凍步驟也不盡相同[13]。為推動液氮保存鉤體菌種的標(biāo)準(zhǔn)化工作,2008年研究人員發(fā)表了詳細(xì)的液氮冷凍來長期保存鉤體菌株的操作規(guī)程,用10%甘油作為冷凍保護(hù),在干冰中快速冷凍,然后立即浸入液氮中。43株鉤體菌株,分別在液氮中儲存6、18和54個月后,菌種復(fù)蘇成功率為100%、93%和83%[15]。

5 面臨的挑戰(zhàn)

為了更好預(yù)防和控制鉤體感染,監(jiān)測鉤體病的主要流行菌群、早期診斷和治療鉤體病,如何長期、有效保存不同血清群鉤體代表株顯著尤為重要。正如前面所述不同的保存方法各有優(yōu)缺點(diǎn),為了確保長期獲得高質(zhì)量的可用的鉤體菌種,應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化鉤體菌種長期保存方法和策略,解決目前面臨的一些問題。

5.1 保存方法的標(biāo)準(zhǔn)化 盡管有多種不同方法推薦用于鉤體菌株的長期保存,包括長期保存在18℃～20 ℃定期傳代、低溫冰凍和液氮保存等。但不同實驗室所用的培養(yǎng)基、保護(hù)劑及其濃度和鉤體凍存濃度也不盡相同,這些因素勢必對保存的鉤體存活率產(chǎn)生一定的影響。為了提高長期保存鉤體的質(zhì)量和存活率,建議由鉤體專業(yè)實驗室牽頭和組織不同鉤體保存方法標(biāo)準(zhǔn)化研究工作,并起草每種保存方法詳細(xì)的操作規(guī)程,以供不同實驗室使用。

此外,為了保持鉤體人用疫苗菌種的毒力與純度,在2020版中國藥典中建議,每種疫苗菌種每傳3～6代后,選用120～220 g豚鼠進(jìn)行定期傳代,取感染豚鼠少量心血接種于液體培養(yǎng)基中以分離鉤體菌種,并對分離的鉤體物進(jìn)行血清學(xué)特性、管家基因檢查和毒力測定[16]。而國外研究機(jī)構(gòu)更傾向于用金黃色地鼠作為鉤體增毒動物模型[5-6],但所有動物體重、鉤體濃度以及后續(xù)如何從動物體內(nèi)分離和獲取鉤體基本都沒有詳細(xì)介紹。因此,為了保證保存鉤體的質(zhì)量,建議推薦開展鉤體增毒動物模型的標(biāo)準(zhǔn)化研究,形成統(tǒng)一的操作規(guī)程。

5.2 深入研究鉤體的毒力變化特性 大量研究證實鉤體多次傳代后,菌株的毒力將明細(xì)降低,甚至消失[5-6,8]。研究人員結(jié)合應(yīng)用多種組學(xué)技術(shù)證實了強(qiáng)毒力的黃疸出血群鉤體賴株基因組中較其無毒株僅存在88個插入或缺失和301個單核苷酸突變位點(diǎn),但蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒株有228個蛋白翻譯、DNA 修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),表明關(guān)鍵基因的突變影響蛋白表達(dá),從而改變菌株的毒力[17]。我們實驗室對4對有毒力菌株包括黃疸出血群賴株、秋季群臨4株、流感傷寒群臨6株及波摩那群羅株及其對應(yīng)的無毒株進(jìn)行比較基因組學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)鉤體菌株通過動物宿主體內(nèi)傳代保持毒力時,共有161個基因受到正選擇影響發(fā)生突變,其中47個為細(xì)菌毒力相關(guān)基因[18]。這些研究結(jié)果提示致病性鉤體中一些基因和蛋白表達(dá)的改變可直接影響細(xì)菌的毒力。

因此,解析其分子和毒力變化內(nèi)在機(jī)制,必將助力長期保存方法優(yōu)化和開發(fā)。

5.3 開展全國范圍內(nèi)鉤體血清和分子流行病調(diào)查 盡管在我們一些傳統(tǒng)鉤體疫區(qū)省份都會進(jìn)行鉤體動物宿主監(jiān)控,但由于各省市實驗室檢測水平參差不齊,且樣本易受采集、分離和檢測手段等因素的影響,可能導(dǎo)致鉤體檢出和報告率偏低[19-20]。事實上,當(dāng)前我國所用的鉤體疫苗株和不同血清群的代表株分離時間均超過30年,現(xiàn)階段是否具有代表性? 至今,基于部分省市分離菌株研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),中國鉤體流行菌株群體獨(dú)特、菌型復(fù)雜,其分子流行趨勢和進(jìn)化歷程可能與其他國家不同[20-21],因此建議系統(tǒng)評價我國鉤體病的疾病負(fù)擔(dān),開展全國范圍內(nèi)鉤體血清和分子流行病調(diào)查,不僅可為完善我國防控鉤體感染提供科學(xué)指導(dǎo),同時也將通過分離培養(yǎng)獲得大量的流行菌株,為后續(xù)鉤體疫苗株和代表株的篩選奠定厚實的菌株資源庫基礎(chǔ)。

5.4 加大鉤體菌種長期保藏的投入 隨著報道鉤體病例數(shù)的降低,各級公共衛(wèi)生防疫部門不可避免將減少該傳染病的關(guān)注。同時,在為數(shù)不多的鉤體專業(yè)實驗室,為了長期保存鉤體菌種,需要定期液體培養(yǎng)基傳代,工作量大,且菌種存在變異、污染和丟失的可能。尤其是生產(chǎn)人用的鉤體疫苗廠家,需要定期進(jìn)行動物體內(nèi)傳代,工藝十分繁瑣,對操作技能要求較高,且由于疫苗市場需求不足,生產(chǎn)的大部分鉤體疫苗成品中報廢又占有相當(dāng)數(shù)量,企業(yè)經(jīng)營的成本壓力偏大,建議應(yīng)由國家層面加大專項經(jīng)費(fèi)投入,不僅有利于鉤體病的防控,也將保障中國鉤體菌種微生物資源長期保藏。

6 結(jié)語

回顧過去幾十年,但隨著生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和技術(shù)的發(fā)展,抗生素不斷更新?lián)Q代以及經(jīng)濟(jì)衛(wèi)生條件的改善,全球在預(yù)防和控制鉤體感染取得了巨大成就,但在一些國家和地區(qū)仍不斷有散發(fā)鉤體感染病例,甚至小規(guī)模鉤體疫情暴發(fā)[22]。因此,長期保藏用于鉤體血清群(型)檢測用的代表性菌株以及用于制備疫苗用的生產(chǎn)菌株仍然重要。為了避免重要鉤體菌種的丟失,推薦現(xiàn)有的鉤體專業(yè)實驗室和疫苗生產(chǎn)廠家至少用2種保存方法對現(xiàn)有代表性菌種和疫苗株進(jìn)行長期保藏。同時,國家應(yīng)該加大對中國微生物資源保藏和整理的經(jīng)費(fèi)投入,開展鉤體菌株長期保存方法及相關(guān)毒力特性研究,開發(fā)完善出簡單、方便且能保留鉤體生存能力以及在長期保藏后遺傳和毒力穩(wěn)定的方法,并以此推動鉤體保存方法標(biāo)準(zhǔn)化。

(感謝武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司孫曉艷給予的幫助。)

利益沖突:無

引用本文格式:徐穎華,葉強(qiáng),徐苗.淺析鉤端螺旋體菌種的長期保存[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(6):469-472.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.090