王檸，何育風(fēng)，揭宇予，左高駢，張龍，易樹堅(jiān)

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)是導(dǎo)致腰腿痛的常見原因之一[1-2]，屬中醫(yī)學(xué)“腰痛”“痹證”范疇。以往的研究證實(shí)，補(bǔ)陽還五湯對于LDH具有較為理想的治療效果[3]，但具體作用機(jī)制尚不明確。為此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了補(bǔ)陽還五湯治療LDH的作用機(jī)制，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)陽還五湯活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)檢索并篩選補(bǔ)陽還五湯組成藥物“黃芪”“當(dāng)歸”“赤芍”“川芎”“紅花”“桃仁”的活性成分(篩選條件：口服生物利用度≥30%，類藥性指數(shù)≥0.18)，然后在TCMSP中查詢活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。在文獻(xiàn)中查詢補(bǔ)陽還五湯組成藥物“地龍”的活性成分，在PubChem中檢索后按照類藥五原則[4]進(jìn)行篩選；下載選定的“地龍”活性成分的3D結(jié)構(gòu)式，導(dǎo)入Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫，獲取對應(yīng)的UniProtID，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為基因名，從而得到對應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2 補(bǔ)陽還五湯治療LDH靶點(diǎn)預(yù)測利用在線人類孟德爾遺傳(online Mendelian inheritance in man，OMIM)數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫、Disgenet數(shù)據(jù)庫檢索LDH的靶點(diǎn)，關(guān)鍵詞為“l(fā)umbar disc herniation”。去除重復(fù)值，得到LDH的靶點(diǎn)并導(dǎo)出檢索結(jié)果。利用R3.6.3軟件將檢索到的補(bǔ)陽還五湯靶點(diǎn)和LDH靶點(diǎn)取交集，得到補(bǔ)陽還五湯治療LDH的靶點(diǎn)。

1.3 補(bǔ)陽還五湯治療LDH主要活性成分篩選分別整理補(bǔ)陽還五湯組成藥物活性成分與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，應(yīng)用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯治療LDH的“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析。

1.4 補(bǔ)陽還五湯治療LDH關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選利用STRING數(shù)據(jù)庫分析補(bǔ)陽還五湯治療LDH的靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，設(shè)定“Organism”條件為“Homo sapiens”，然后利用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，篩選補(bǔ)陽還五湯治療LDH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 補(bǔ)陽還五湯治療LDH靶點(diǎn)基因功能及信號通路分析利用R3.6.3軟件對1.2中得到的補(bǔ)陽還五湯治療LDH的靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析(篩選條件均為P<0.05)，挖掘靶點(diǎn)的生物學(xué)功能和通路信息。

1.6 補(bǔ)陽還五湯治療LDH主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接從TCMSP和PubChem數(shù)據(jù)庫下載主要活性成分的結(jié)構(gòu)、從PDB數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，通過OpenBabel3.0軟件、Auto Dock1.5.6軟件進(jìn)行加氫、去電荷等處理，借助PyMOL軟件尋找活性口袋，最后采用Vina軟件進(jìn)行分子對接。

2 結(jié) 果

2.1 補(bǔ)陽還五湯活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果共篩選到補(bǔ)陽還五湯的活性成分114個、靶點(diǎn)1151個，去除重復(fù)后獲得活性成分47個、靶點(diǎn)265個(表1、表2)。

表1 補(bǔ)陽還五湯活性成分及靶點(diǎn)數(shù)量

表2 補(bǔ)陽還五湯活性成分篩選結(jié)果

續(xù)表2

2.2 補(bǔ)陽還五湯治療LDH靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果從OMIM數(shù)據(jù)庫、GeneCard數(shù)據(jù)庫、Disgenet數(shù)據(jù)庫共檢索到LDH的靶點(diǎn)392個。將補(bǔ)陽還五湯靶點(diǎn)和LDH靶點(diǎn)取交集后得到補(bǔ)陽還五湯治療LDH的靶點(diǎn)46個。

2.3 補(bǔ)陽還五湯治療LDH主要活性成分篩選結(jié)果補(bǔ)陽還五湯治療LDH的“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(圖1)顯示，補(bǔ)陽還五湯7種組成藥物的47個活性成分通過調(diào)控46個靶點(diǎn)治療LDH，度值排名前4的活性成分，即主要活性成分為槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)及黃芩素(baicalein)。

注：紫色和黃色代表補(bǔ)陽還五湯活性成分，紅色代表補(bǔ)陽還五湯治療腰椎間盤突出癥靶點(diǎn)。

2.4 補(bǔ)陽還五湯治療LDH關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選結(jié)果補(bǔ)陽還五湯治療LDH的靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖2)顯示，度值排名前6的靶點(diǎn)，即補(bǔ)陽還五湯治療LDH的關(guān)鍵靶點(diǎn)分別為JUN原癌基因(JUN proto-oncogene，JUN)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、腫瘤蛋白P53(tumor protein P53，TP53)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)。

圖2 補(bǔ)陽還五湯治療腰椎間盤突出癥靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 補(bǔ)陽還五湯治療LDH靶點(diǎn)基因功能及信號通路分析結(jié)果GO分析共得到2013個富集結(jié)果，其中生物過程1946個，主要涉及對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)等生物過程進(jìn)行調(diào)節(jié)；細(xì)胞組分33個，主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞組分；分子功能124個，主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、內(nèi)肽酶活性等；生物過程、細(xì)胞組分、分子功能前10位的結(jié)果見圖3。KEGG分析共得到142個富集結(jié)果，主要涉及晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product，AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced glycation end product receptor，RAGE)信號通路、白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)信號通路、TNF信號通路等，前30位的結(jié)果見圖4。

圖3 補(bǔ)陽還五湯治療腰椎間盤突出癥靶點(diǎn)基因GO分析柱狀圖

圖4 補(bǔ)陽還五湯治療腰椎間盤突出癥靶點(diǎn)基因KEGG分析柱狀圖

2.6 補(bǔ)陽還五湯治療LDH主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接結(jié)果分子對接結(jié)果顯示，4個主要活性成分(槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素)與6個關(guān)鍵靶點(diǎn)(JUN、TNF、AKT1、MAPK1、TP53、MMP9)均具有良好的結(jié)合能力，結(jié)合能均≤-5.0 kJ·mol-1(表3、圖5)。

表3 補(bǔ)陽還五湯治療腰椎間盤突出癥主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能 單位：kJ·mol-1

圖5 補(bǔ)陽還五湯治療腰椎間盤突出癥主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接圖

3 討 論

補(bǔ)陽還五湯出自清代醫(yī)家王清任所著的《醫(yī)林改錯》，方中黃芪大補(bǔ)脾胃之氣，氣旺血行，瘀去絡(luò)通；當(dāng)歸活血養(yǎng)血，化瘀而不傷血；赤芍、川芎、桃仁、紅花協(xié)同當(dāng)歸活血祛瘀、行氣通絡(luò)；地龍通經(jīng)活絡(luò)，力專善走，周行全身。全方標(biāo)本兼顧，補(bǔ)氣而不壅滯、活血而不傷正，諸藥合用，共奏補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之功。

通過活性成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測，共獲得補(bǔ)陽還五湯的活性成分47個、靶點(diǎn)265個；從多個數(shù)據(jù)庫共獲得LDH的靶點(diǎn)392個，通過與補(bǔ)陽還五湯靶點(diǎn)取交集后得到補(bǔ)陽還五湯治療LDH的靶點(diǎn)46個。這提示補(bǔ)陽還五湯可能通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮治療LDH的作用。構(gòu)建的“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)顯示，槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素的度值較高，可能是補(bǔ)陽還五湯治療LDH的主要活性成分。

免疫和炎癥反應(yīng)是引起LDH的重要機(jī)制之一[5]。槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素均為黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗病毒作用[6]。Rotelli等[7]認(rèn)為，槲皮素可阻斷5-羥色胺產(chǎn)生的急性炎癥反應(yīng)。木犀草素主要通過作用于核因子-κB途徑中的原癌基因酪氨酸蛋白激酶、激活蛋白AP-1途徑中的MAPK、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄激活因子途徑中的細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)3，來達(dá)到抗炎作用[8]。山柰酚可通過抑制脂肪形成、炎癥、氧化應(yīng)激、破骨細(xì)胞自噬和成骨細(xì)胞凋亡，同時激活成骨細(xì)胞自噬來實(shí)現(xiàn)骨骼保護(hù)作用[9]。研究表明，黃芩素可通過減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10]。

靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示，JUN、TNF、AKT1、MAPK1、MMP9、TP53可能是補(bǔ)陽還五湯治療LDH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。JUN由多種蛋白復(fù)合體組成，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程。TNF是一種由巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞在急性炎癥過程中產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)一系列導(dǎo)致壞死或凋亡的信號事件。Johnson等[11]認(rèn)為，椎間盤退變主要表現(xiàn)為細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化，而細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化是椎間盤力學(xué)特性喪失，從而導(dǎo)致椎間盤退變的主要原因，而MMP是細(xì)胞基質(zhì)降解酶中的主要酶類。在生理?xiàng)l件下，MMP可水解衰老和受損的椎間盤組織，其過度活化會導(dǎo)致椎間盤的退化并引起疼痛[12]。Lu等[13]的研究表明，TP53和血管內(nèi)皮生長因子基因協(xié)同表達(dá)在退化的椎間盤組織中，共同作用于新生血管，加速椎間盤組織退化。

補(bǔ)陽還五湯治療LDH的靶點(diǎn)基因功能及信號通路富集分析結(jié)果顯示，補(bǔ)陽還五湯治療LDH的分子生物學(xué)機(jī)制主要涉及AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路，參與對營養(yǎng)水平、氧化應(yīng)激、脂多糖以及細(xì)菌起源分子的反應(yīng)等生物過程。AGE-RAGE信號通路已被證實(shí)可通過激活Nox-1和減少SOD-1的表達(dá)來增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]。另一項(xiàng)研究指出，RAGE的激活會引起與衰老相關(guān)的輕度全身性炎癥反應(yīng)[15]。IL-17家族通過相應(yīng)的受體發(fā)出信號，激活包括核因子-κB、MAPK和增強(qiáng)子結(jié)合蛋白在內(nèi)的下游途徑，誘導(dǎo)抗菌肽、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，在急性和慢性炎癥反應(yīng)中都起著至關(guān)重要的作用[9]。Jiang等[16]的研究表明，LDH患者椎間盤組織中IL-17和TNF基因表達(dá)高于健康人群。TNF是引起椎間盤退變的主要炎癥物質(zhì)之一，其作用機(jī)制主要是通過上調(diào)椎間盤細(xì)胞內(nèi)MMP的活性，減少蛋白聚糖、膠原等物質(zhì)誘導(dǎo)的彈性蛋白，抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成，造成不可逆性破壞[11]。分子對接結(jié)果顯示，補(bǔ)陽還五湯治療LDH的主要活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚及黃芩素與關(guān)鍵靶點(diǎn)JUN、TNF、AKT1、MAPK1、TP53、MMP9均具有較強(qiáng)的結(jié)合力。

本研究的結(jié)果提示，補(bǔ)陽還五湯可能是通過調(diào)控AGE-RAGE、IL-17及TNF等信號通路，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥因子表達(dá)，發(fā)揮對LDH的治療作用；槲皮素、木犀草素、山柰酚及黃芩素可能是補(bǔ)陽還五湯治療LDH的主要活性成分，JUN、TNF、AKT1、MAPK1、MMP9、TP53是對應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。