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      基于化學(xué)成分變化對炆遠(yuǎn)志“減毒”效應(yīng)研究

      2022-07-22 12:16:24丁平平易斌陳華師陳明霞呂尚張青陳西勇饒毅
      關(guān)鍵詞:遠(yuǎn)志炮制抑制率

      丁平平 ,易斌 ,陳華師 ,陳明霞,4,呂尚 ,2,張青 ,陳西勇,饒毅 ,2

      (1.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌 330004;2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心,江西 南昌 330000;3.江西建昌幫藥業(yè)有限公司,江西 撫州 344000;4.北京斯利安藥業(yè)有限公司,北京 100176)

      遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志(PolygalatenuifoliaWilld.)的干燥根,主要含有三萜皂苷類、寡糖酯類、酮類成分[1-2]。其中遠(yuǎn)志皂苷類成分包括遠(yuǎn)志皂苷A、B、C、D等多種原型皂苷,經(jīng)高溫炮制后水解成具有相同母核的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和遠(yuǎn)志酸(見圖1)。遠(yuǎn)志既具有安神益智、祛痰、消腫的作用,同時還對胃腸道有刺激性[3-4]。文獻(xiàn)研究表明,遠(yuǎn)志經(jīng)蜜炙后遠(yuǎn)志皂苷B的含量下降,從而降低了胃腸道毒性,因此可將遠(yuǎn)志進(jìn)行炮制以降低胃腸道毒性[5-6]。歷代醫(yī)方本草對遠(yuǎn)志的炮制方法記載眾多,甘草制遠(yuǎn)志習(xí)稱制遠(yuǎn)志,首載于《雷公炮炙論》,是目前臨床應(yīng)用最多的炮制品,為2020年版《中國藥典》所收載。炆法炮制為江西建昌幫藥業(yè)有限公司獨(dú)門炮制技藝,經(jīng)考證最早出自明朝繆希雍《炮炙大法》,早在東晉葛洪已有應(yīng)用,具有“工具輔料獨(dú)特,工藝取法烹飪,講究形色氣味,毒性低療效高”的炮制風(fēng)格,在贛閩地區(qū)廣為流傳,代表飲片有炆熟地、炆黃精、炆遠(yuǎn)志等[7-8]。目前,未見炆遠(yuǎn)志化學(xué)成分與毒性關(guān)系的研究報(bào)道。

      圖1 遠(yuǎn)志中的皂苷類成分結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structural formula of saponins in P.tenuifolia

      本文以炆遠(yuǎn)志為研究樣品,與生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志進(jìn)行對比研究,選用遠(yuǎn)志原型皂苷類成分中含量較高的遠(yuǎn)志皂苷B為代表,以及遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3,6′-二芥子?;崽酋?、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志酸為檢測指標(biāo),分析遠(yuǎn)志炆制過程各成分之間的變化規(guī)律;并針對具有毒性的遠(yuǎn)志皂苷B變化情況,采用小鼠小腸上皮隱窩細(xì)胞(IEC-6細(xì)胞)為模型,以IC50和可間接反應(yīng)機(jī)體組織細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)為指標(biāo)[9-12],比較3者對胃腸道的毒性,研究炆遠(yuǎn)志化學(xué)成分變化與毒性之間的關(guān)系。

      1 材料與儀器

      1.1 材料

      遠(yuǎn)志藥材:批號 Y068-201204、Y068-201206、Y068-201210,由江西建昌幫藥業(yè)有限公司提供,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)付小梅教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志(PolygalatenuifoliaWilld.)的干燥根。

      小鼠小腸上皮隱窩細(xì)胞系(IEC-6細(xì)胞),購自中喬新舟生物公司。

      DMEM高糖培養(yǎng)基(Solarbio,批號:12100);胎牛血清(ExCell Bio,批號:FSP500);PBS磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.2-7.4,Solarbio,批號:P1020);0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio,批號:T1300);二甲亞砜(DMSO,POWER CELL,批號:O1028A);Cell Counting Kit-8(meilunbio,批號:MA0218-3-Mar-05G)。丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(批號:A003-1-2)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒(批號:A006-2-1)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒(批號:A001-3-2)均購自南京建成生物工程研究所。3,6′-二芥子酰基蔗糖酯(批號:20021903,純度≧98.0%)、遠(yuǎn)志酮Ⅲ(批號:YRY144-200401,純度≧98.0%)、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷(批號:PS000954,純度≧98.0%)、遠(yuǎn)志皂苷B(批號:35906-36-6,純度≧98.0%)、遠(yuǎn)志酸(批號:110796-201922,純度>99.2%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。

      1.2 儀器

      LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司);KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AB104-N萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司);AUW2200十萬分之一電子分析天平(日本島津公司);Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司);恒溫電熱套(常州國華公司);SpectraMax I3多功能酶標(biāo)儀(MD,USA美國);BA410生物顯微鏡(廈門Motic公司);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(NAPCO)。

      2 方法

      2.1 炮制品的制備

      生遠(yuǎn)志:取遠(yuǎn)志藥材,洗凈,去除遠(yuǎn)志木質(zhì)心,

      2.2 遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3,6′-二芥子?;崽酋ズ图?xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量測定

      采用2020年版《中國藥典》“遠(yuǎn)志”項(xiàng)下的方法。

      2.3 遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志酸的含量測定

      2.3.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈(A)-0.05%甲酸溶液(B)為流動相,梯度洗脫(0~5 min,85%~75%B;5~10 min,75%~65%B;10~50 min,65%~53%B);檢測波長:210 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:30℃。

      2.3.2 對照品溶液的制備 取遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志酸對照品適量,精密稱定,分別加70%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇制成每1 mL含1 mg遠(yuǎn)志皂苷B、0.2 mg遠(yuǎn)志酸的溶液,即得。

      2.3.3 供試品溶液的制備 取生遠(yuǎn)志(Y068-201204、Y068-201206、Y068-201210)按“2.1”項(xiàng)下炆遠(yuǎn)志炮制工藝進(jìn)行炮制,分別于炆制過程中的不同時間點(diǎn)進(jìn)行取樣。精密稱取各遠(yuǎn)志樣品粉末約0.5 g,精密加入70%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲提取30 min,放冷,稱定質(zhì)量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,過濾即可。

      2.3.4 測定方法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定,即得。

      2.4 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

      稱取生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及炆遠(yuǎn)志,精密加入70%甲醇提取2次,減壓濃縮回收溶劑后,真空干燥制得干膏。分別精確稱定生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及炆遠(yuǎn)志干膏加入適量DMSO溶解,制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL(按飲片計(jì))母液。遠(yuǎn)志皂苷B用DMSO溶解,制成10 mg/mL的母液,實(shí)驗(yàn)時再以含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液(以下簡稱為完全培養(yǎng)基)進(jìn)行等比例稀釋,得各所需濃度稀釋液,用于小鼠小腸上皮隱窩IEC-6細(xì)胞毒性試驗(yàn)。

      2.4.1 CCK-8測定細(xì)胞抑制率 將小鼠小腸上皮隱60℃烘箱鼓風(fēng)干燥,即可。

      制遠(yuǎn)志:參照2020年版《中國藥典》項(xiàng)下方法炮制。取甘草,加適量水煎湯,去渣,加入凈遠(yuǎn)志,用文火煮至湯吸盡,取出,干燥,即得制遠(yuǎn)志[3]。

      炆遠(yuǎn)志:取凈遠(yuǎn)志和甘草,一同放入炆藥罐內(nèi),加入溫水(45~50℃)適量,上蓋,將罐移至圍灶內(nèi),堆放干糠于四周,點(diǎn)火加熱,炆制16 h,至罐內(nèi)汁水吸盡,取出,篩去甘草,65℃干燥至半干后,取出拌入藥汁,待藥汁吸盡后繼續(xù)干燥,即得炆遠(yuǎn)志[13]。該炮制方法由江西建昌幫藥業(yè)提供。窩細(xì)胞IEC-6在含10%FBS的高糖DMEM中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。試驗(yàn)分為對照組(含有細(xì)胞的未給藥組)、空白組(不含細(xì)胞的未給藥組)、不同炮制工藝的遠(yuǎn)志樣品組和遠(yuǎn)志皂苷B組。參照文獻(xiàn)[12-15],取對數(shù)生長期的IEC-6細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為 5×105個/mL,每孔 100 μL接種于96孔板中,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天取出,棄去上清液,分別于細(xì)胞中加入以上稀釋至不同濃度的生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B單體藥液,每個濃度6個復(fù)孔;同時設(shè)置未加藥液的對照組。將處理好的細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培育24 h。取出,分別加入CCK-8試劑200 μL,繼續(xù)培養(yǎng)1 h后停止,在450 nm波長處進(jìn)行測定,計(jì)算細(xì)胞抑制率及IC50值。

      2.4.2 細(xì)胞中MDA、SOD、GSH的測定 根據(jù)細(xì)胞抑制試驗(yàn)結(jié)果,分別設(shè)置生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B單體的高、中、低3個濃度組及對照組(含有細(xì)胞的未給藥組)、空白組(不含細(xì)胞的未給藥組)。取對數(shù)生長期的IEC-6細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1.2×106個/mL,每孔2 mL接種于6孔板中,置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天取出,棄去上清液,加入預(yù)配置的樣品溶液,同時設(shè)置對照組,每組6個復(fù)孔,將處理好的細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培育24 h。將培養(yǎng)好的細(xì)胞,根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行樣品前處理及MDA、GSH、SOD的測定[5-7]。

      3 結(jié)果及討論

      3.1 遠(yuǎn)志炆制過程及遠(yuǎn)志不同炮制品的含量測定

      遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志酸的含量測定方法學(xué)考察結(jié)果顯示,遠(yuǎn)志皂苷B及遠(yuǎn)志酸的線性回歸方程分別為y=2 793.80x+22 348.71、y=4 662.78x+2 830.06,線性范圍分別為 15.47~494.90 μg/mL、6.31~201.88 μg/mL,相關(guān)系數(shù)分別為0.997 6、0.999 6。精密度試驗(yàn)RSD值分別為0.13%、2.99%(n=6),穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD 值分別為 1.32%、0.83%(n=6),重現(xiàn)性試驗(yàn)RSD值分別為0.81%、1.18%,平均加樣回收率分別為98.97%和98.55%、RSD值分別為0.93%和1.21%。以上結(jié)果表明遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志酸含量測定方法可行,符合要求。

      對3批次炆遠(yuǎn)志炮制過程中的5個成分的變化進(jìn)行檢測,并與制遠(yuǎn)志進(jìn)行比較。結(jié)果見表1、圖2-4。

      圖2 生品及不同炮制品中遠(yuǎn)志酮Ⅲ及3,6-二芥子?;崽酋ズ繙y定HPLC圖譜Figure 2 Chromatogram of determination of polyxanthoneⅢand 3,6-dicarinoacyl sucrose ester in crude P.tenuifolia and different processed product by HPLC

      圖3 生品及不同炮制品中遠(yuǎn)志皂苷B及遠(yuǎn)志酸含量測定HPLC圖譜Figure 3 Chromatogram of determination of polygenin B and polygenic acid in crude P.tenuifolia and different processed product by HPLC

      圖4 生品及不同炮制品中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量測定HPLC圖譜Figure 4 Chromatogram determination of polygala saponin in crude P.tenuifolia and different processed product by HPLC

      表1 5種化學(xué)成分的含量測定結(jié)果Table 1 Content determination of five chemical compositions(n=3) w/%

      3.2 細(xì)胞抑制率試驗(yàn)

      通過體外培養(yǎng)小鼠小腸上皮隱窩細(xì)胞IEC-6,以抑制率和IC50為指標(biāo),考察生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B單體在不同濃度下的細(xì)胞毒作用,見表2。結(jié)果表明,各組藥物都顯示出了明顯的細(xì)胞毒作用,且呈明顯劑量依賴關(guān)系;但在同一濃度下,制遠(yuǎn)志的細(xì)胞抑制率小于生遠(yuǎn)志,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),炆遠(yuǎn)志的細(xì)胞抑制率明顯低于生遠(yuǎn)志和制遠(yuǎn)志,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);同時,生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B單體的IC50值依次為0.423、0.699、1.386、0.039 mg/mL。綜合抑制率和IC50值可以看出,3種遠(yuǎn)志對細(xì)胞的毒性順序?yàn)樯h(yuǎn)志>制遠(yuǎn)志>炆遠(yuǎn)志。

      表2 生遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B的細(xì)胞抑制率Table 2 Inhibition rate of crude P.tenuifolia,stewed P.tenuifolia,processed P.tenuifolia and polygala saponin B on cells(±s,n=6)

      表2 生遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B的細(xì)胞抑制率Table 2 Inhibition rate of crude P.tenuifolia,stewed P.tenuifolia,processed P.tenuifolia and polygala saponin B on cells(±s,n=6)

      與生遠(yuǎn)志各濃度組比較:*P<0.05,**P<0.01;與制遠(yuǎn)志各濃度組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01。

      組別生遠(yuǎn)志ρ/(mg·mL-1)2 1 IC50/(mg·mL-1)0.423 95%的可信區(qū)間0.357~0.501 0.5 0.25 0.125 0.062 5制遠(yuǎn)志2 1 0.6990.610~0.803 0.5 0.25 0.125 0.062 5炆遠(yuǎn)志2 1 1.3861.317~1.431遠(yuǎn)志皂苷B 0.5 0.25 0.125 0.062 5 0.632 0.326 0.161 0.083 0.044 0.022細(xì)胞抑制率/%99.577±1.860 79.983±1.450 66.071±0.983 51.864±0.731 35.995±0.820 18.295±0.601 99.851±1.415 83.700±1.050*68.330±0.713*49.641±0.571*34.478±0.840*24.070±0.451**80.195±1.755**▲▲65.337±0.880**▲▲54.230±0.753*▲▲44.559±0.881**▲▲34.532±0.460 22.152±0.803**▲97.521±1.420 87.070±1.150**▲70.517±1.283**65.641±0.811**▲▲51.842±1.680**▲▲41.251±0.851**▲▲0.0390.031~0.049

      采用在遠(yuǎn)志原型皂苷中含量相對較高的遠(yuǎn)志皂苷B進(jìn)行比較。生遠(yuǎn)志中含有與遠(yuǎn)志皂苷B為代表的原型遠(yuǎn)志皂苷含量較高,IC50值最小,毒性最大。而炆遠(yuǎn)志中含有的遠(yuǎn)志皂苷B含量最少,IC50值最大,毒性較小。

      3.3 MDA、GSH、SOD指標(biāo)的測定

      據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的含量高低可間接反應(yīng)機(jī)體組織細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度,即MDA的值越大,SOD及GSH的值越小,毒性越大[9-11]。因此選擇MDA、SOD、GSH進(jìn)行測定,來進(jìn)一步探討炆制“減毒”的原因。

      從表3可見:與對照組比較,生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志的各組細(xì)胞GSH和SOD的含量明顯降低(P<0.01),MDA含量明顯增加(P<0.01);與生遠(yuǎn)志組比較,制遠(yuǎn)志和炆遠(yuǎn)志各組的GSH及SOD的含量均顯著增加(P<0.01),MDA 的含量顯著降低(P<0.01),說明生遠(yuǎn)志經(jīng)過炮制后的制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志毒性顯著降低;與制遠(yuǎn)志進(jìn)行比較,炆遠(yuǎn)志各檔次濃度組的GSH及SOD的含量均顯著增加(P<0.01),MDA的含量顯著降低(P<0.01),說明炆遠(yuǎn)志毒性與制遠(yuǎn)志比較顯著降低;遠(yuǎn)志皂苷B單體對MDA、SOD、GSH的含量變化與生遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志和制遠(yuǎn)志的變化相反,證明其具有較強(qiáng)的胃腸道毒性。

      表3 生遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B對GSH、SOD、MDA的影響Table 3 Effects of crude P.tenuifolia,stewed P.tenuifolia,processed P.tenuifolia and polygala saponin B on GSH,SOD and MDA(±s,n=6)

      表3 生遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B對GSH、SOD、MDA的影響Table 3 Effects of crude P.tenuifolia,stewed P.tenuifolia,processed P.tenuifolia and polygala saponin B on GSH,SOD and MDA(±s,n=6)

      與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01;與生遠(yuǎn)志各濃度組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01;與制遠(yuǎn)志各濃度組比較:■P<0.05,■■P<0.01。

      組別對照生遠(yuǎn)志ρ/(mg·mL-1)0 2 1 0.5制遠(yuǎn)志2 1 0.5炆遠(yuǎn)志2 1遠(yuǎn)志皂苷B 0.5 0.161 0.083 0.044 GSH/(μmol·g-1)96.346±9.531 36.121±0.20**46.527±0.528**56.399±0.347**46.321±0.293**▲▲56.572±0.43**▲▲66.504±0.492**▲▲60.255±0.243**▲▲■■72.173±0.63**▲▲■■84.273±0.382**▲▲■■10.209±0.603**▲▲■■14.294±0.45**▲▲■■16.371±0.523▲▲■■SOD/(μmol·g-1)831.071±12.434 380.486±5.025**442.168±8.513**500.310±7.941**400.341±10.530**▲▲460.636±11.904**▲520.165±12.070**▲560.378±10.460**▲▲■■634.384±8.364**▲▲■■696.834±9.240**▲▲■■105.400±9.342**▲▲■■122.592±1.412**▲▲■■157.291±2.457**▲▲■■MDA/(μmol·g-1)10.334±0.870 70.783±9.202**60.354±8.289**50.275±0.350**60.167±5.135**50.257±1.752**40.376±1.457**▲▲44.791±5.685**▲■34.474±1.142**▲▲■■24.426±1.787**▲▲■■34.417 ±6.134**▲▲■■30.271±1.127**▲▲■■25.435±1.346**▲▲■■

      4 小結(jié)

      遠(yuǎn)志中原型皂苷類成分(如遠(yuǎn)志皂苷B)既是遠(yuǎn)志祛痰鎮(zhèn)咳、抗癡呆和腦保護(hù)的活性成分,也是對胃腸道刺激的毒性成分[1-4,17-19]。此類成分因炮制受熱,糖苷鍵斷裂,水解為毒性較低的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷等成分,導(dǎo)致含量降低,從而降低胃腸道毒性。本文通過比較原型皂苷類中含量較高遠(yuǎn)志皂苷B的含量大小,結(jié)果顯示生遠(yuǎn)志>制遠(yuǎn)志飲片>炆遠(yuǎn)志飲片。推測原因是由于炆法炮制需加熱炮制16 h,時間長,而制遠(yuǎn)志炮制時間是幾小時,時間較短,導(dǎo)致炆遠(yuǎn)志中遠(yuǎn)志皂苷B含量更低。另外,從IEC-6細(xì)胞胃腸道毒性試驗(yàn)結(jié)果可見,IC50和MDA、GSH、SOD的含量變化,均表明毒性大小為生遠(yuǎn)志>制遠(yuǎn)志>炆遠(yuǎn)志。推測遠(yuǎn)志皂苷B含量的降低為遠(yuǎn)志胃腸毒性減小的原因之一,該結(jié)果可為炆遠(yuǎn)志的炮制提供參考,為炆遠(yuǎn)志的“減毒”效應(yīng)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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