陳瓊 梅紅 王寶香 趙玉霞 高源

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢兒童醫(yī)院 1.消化內(nèi)科；2.內(nèi)鏡中心，湖北 武漢 430016)

潰瘍性結腸炎是一種反復發(fā)作、病因不明的慢性結腸炎，被認為是結腸癌的癌前癥狀，世界衛(wèi)生組織(WHO)列為現(xiàn)代難治性疾病之一[1]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學治療常用水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑等藥物對潰瘍性結腸炎進行治療，優(yōu)勢在于能夠迅速控制炎癥，誘導緩解，但長期服用存在副作用大的問題[2]。中草藥已被證明可有效治療慢性炎性疾病，且副作用較小。柚皮素是一種生物類黃酮，具有抗炎和抗氧化劑等多種功能[3]。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素通過減少腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的積累和抑制細胞凋亡，對腸缺血/再灌注損傷具有保護作用，但其對潰瘍性結腸炎的研究較少[4]。潰瘍性結腸炎的病變部位主要見于結腸黏膜下層到整個黏膜的區(qū)域，表現(xiàn)為炎癥誘導的腸細胞凋亡過度[5]。10號染色體缺失張力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)，通過調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路，有助于調(diào)節(jié)炎癥反應和腸炎的腸上皮細胞凋亡[6]。微小RNA(microRNA，miRNA)在細胞代謝調(diào)節(jié)中起著重要作用[7]。在脂多糖誘導的膿毒癥中，miR-30a-3p過表達可以抑制脂多糖誘導的細胞凋亡[8]。利用TargetScan軟件發(fā)現(xiàn)，miR-30a-3p通過調(diào)控PTEN的表達參與細胞的病理生理過程，提示PTEN可能是miR-30a-3p的潛在靶點。因此，本研究通過制備潰瘍性結腸炎模型，觀察柚皮素對該模型的治療作用，并探討miR-30a-3p/PTEN信號軸在整個過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取60只健康BALB/c小鼠，雄性，購自武漢大學實驗動物中心，體質(zhì)量(20±2) g，動物許可證號：HNXK(鄂)2020-0005，適應性喂養(yǎng)在溫度(23±2)℃，相對濕度60%～70%，光照12 h明暗交替的環(huán)境中1周。本實驗小鼠的處理符合動物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2 主要試劑與儀器 潑尼松龍、柚皮素和右旋葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sodium Sulfate，DSS) (美國Sigma公司)；蘇木素染色液(上海碧云天生物技術研究所)；白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、PTEN、PI3K、Akt和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(上海生工生物技術有限公司)；引物由上海生工生物技術有限公司合成；組織脫水機、包埋機、全自動輪轉(zhuǎn)切片機等病理配套設備(上海珂淮儀器有限公司)；XSP-9CA顯微鏡(上海光學儀器一廠)；MultiSkan FC型酶標儀[美谷生物科技(浙江)有限公司]；NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)；CFX96型實時熒光定量PCR儀(美國BD公司)。

1.3 分組及造模 小鼠按隨機數(shù)字表法均分為陰性對照組、模型組、陽性對照組、柚皮素低劑量組、柚皮素中劑量組和柚皮素高劑量組。陰性對照組灌胃給予生理鹽水(灌胃體積0.2 mL/10g)，其余各組灌胃給予含5% DSS的生理鹽水溶液(灌胃體積0.2 mL/10g)，連續(xù)給予兩周后陰性對照組和模型組灌胃給予生理鹽水(0.2 mL/10g)，陽性對照組灌胃給予潑尼松龍(2 mg/kg)，柚皮素低、中、高劑量組分別灌胃給予柚皮素(劑量依次為50、100、200 mg/kg)，持續(xù)給予7d[9-10]。觀察整個實驗期間小鼠的進食、飲水和精神狀態(tài)等一般情況，對小鼠進行稱重、觀察糞便性狀和便血情況，計算疾病活動度評分(Disease activity index，DAI)，DAI=(體重下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血情況分數(shù))/3。脊髓脫臼處死小鼠，取整段結腸(回盲部至肛門)肉眼觀察黏膜及漿膜面的變化。將腸組織分成兩份，一份用福爾馬林固定，其余組織液氮保存。

1.4 腸組織形態(tài)學檢查 腸組織經(jīng)脫水、包埋、切片(1 μm)，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，用顯微鏡觀察腸組織學變化。

1.5 ELISA法檢測腸組織中IL-4、IL-10、TNF-α、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3蛋白水平 取部分凍存的腸組織，制成勻漿，將相應一抗稀釋至10 μg/mL，加入到96孔板中(0.1 mL/孔)，4℃過夜，洗滌3次，加腸組織勻漿(0.1 mL)于上述反應孔中，37℃孵育1 h；加入新配置相對應的二抗0.1 mL，孵育1 h；加入新配置的3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethyl benzidine，TMB)底物溶液0.1 mL，顯色20 min；加入2 mol/L硫酸0.05 mL終止反應，于450 nm處測各孔吸光度(A)值。

1.6 實時熒光PCR(RT-PCR)檢測腸組織中miR-30a-3p、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3 mRNA水平 取部分凍存的腸組織，制成勻漿，加入1 mL Trizol法提取總RNA，用NanoDrop 2000c型蛋白核酸檢測儀進行RNA的濃度和純度的測定，根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，再根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明，制備20 μL反應體系進行擴增，在CFX-96 PCR擴增儀中進行擴增。反應條件為預變性(95℃，4 min)、變性(94℃，30 s)、退火(58℃，30 s)、延長(72℃，1 min)，共40個循環(huán)，采用 2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量(以GAPDH作為內(nèi)對照)。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 柚皮素對小鼠DAI評分的影響 造模結束時，與陰性對照組比較，其余各組小鼠DAI評分均升高(P<0.05)；給予治療后，與模型組比較，陽性對照組和各柚皮素劑量組小鼠DAI評分較模型組均降低，各柚皮素劑量組效應呈劑量反應關系(P<0.05)；柚皮素高劑量組與陽性對照組DAI評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 各組小鼠DAI評分比較

2.2 柚皮素對小鼠結腸病理的影響 陰性對照組小鼠結腸無明顯病理改變；模型組小鼠結腸有部分腸壁凹陷，形成潰瘍，周圍組織水腫明顯，部分細胞壞死、脫落，炎性細胞浸潤；柚皮素低劑量組和柚皮素中劑量組小鼠結腸也可見到潰瘍，但組織水腫、細胞壞死和炎細胞浸潤減輕；陽性對照組和柚皮素高劑量組小鼠結腸潰瘍較少，但組織水腫、細胞壞死和炎細胞浸潤明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學病理圖(HE染色，200×)

2.3 柚皮素對小鼠結腸組織中IL-4、IL-10和TNF-α水平影響 與陰性對照組比較，其余各組小鼠結腸組織中IL-4和TNF-α水平均升高，IL-10水平均降低(均P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和各柚皮素劑量組小鼠結腸組織中IL-4和TNF-α水平均降低，IL-10水平均升高，各柚皮素劑量組效應呈劑量反應關系(均P<0.05)；柚皮素高劑量組與陽性對照組各指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠結腸組織中IL-4、IL-10和TNF-α水平比較

2.4 柚皮素對小鼠結腸組織中miR-30a-3p、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3 mRNA及蛋白水平的影響 與陰性對照組比較，其余各組小鼠結腸組織中miR-30a-3p、PI3K和Akt mRNA相對表達量及蛋白水平均降低，PTEN和Caspase-3 mRNA相對表達量及蛋白水平均升高(均P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和各柚皮素劑量組小鼠結腸組織中miR-30a-3p、PI3K和Akt mRNA相對表達量及蛋白水平均升高，PTEN和Caspase-3 mRNA相對表達量及蛋白水平均降低，各柚皮素劑量組效應呈劑量反應關系(均P<0.05)；柚皮素高劑量組與陽性對照組各指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4～5、圖2。

表4 各組小鼠結腸組織中miR-30a-3p、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3 mRNA比較

表5 各組小鼠結腸組織中miR-30a-3p、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3 蛋白比較

圖2 各組小鼠結腸組織中miR-30a-3p、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3 mRNA擴增情況

3 討論

潰瘍性結腸炎是一種復發(fā)性慢性結腸炎，因其頑固性和易復發(fā)性被列為現(xiàn)代難治性疾病。關于潰瘍性結腸炎的臨床藥物開發(fā)和治療的研究較多，但目前還未發(fā)現(xiàn)突破性藥物。因此，探討新的潰瘍性結腸炎治療藥物具有重要意義。多酚或酚類化合物是從藥用植物中提取的天然活性成分，類黃酮被歸類為多酚的結構基團。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇、槲皮素、楊梅素和柚皮素等多酚類和類黃酮化合物被認為對醋酸和DSS誘導的小鼠實驗性結腸炎有保護作用[11]。柚皮素具有較強的抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能。在潰瘍性結腸炎發(fā)生過程中，游離脂肪酸(FFA)水平升高，F(xiàn)FA通過對Toll樣受體4多克隆抗體(TLR4)的作用產(chǎn)生促炎細胞因子，然后啟動核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)和c-JunN端蛋白激酶(c-JNK)級聯(lián)反應，導致腸系膜脂肪組織的慢性炎癥[12]。TNF-α誘導多種炎癥基因表達，促進潰瘍性結腸炎的發(fā)展[13]。同時，IL-4通過刺激中性粒細胞浸潤和趨化產(chǎn)生組織壞死和破壞，抑制Th1/Th2細胞分泌IL-10產(chǎn)生，在潰瘍性結腸炎的發(fā)病機制中起著關鍵作用[14]。本研究結果顯示，柚皮素能降低潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中IL-4和TNF-α水平降低，同時升高IL-10水平，提示柚皮素對促炎細胞因子有抑制作用，從而對潰瘍性結腸炎發(fā)揮保護作用。

潰瘍性結腸炎通常表現(xiàn)為體重減輕、糞便粘稠和便血，統(tǒng)稱為DAI，是評價潰瘍性結腸炎嚴重程度的一個眾所周知的參數(shù)，也是藥物治療效果的一個預測因素[15]。本研究結果顯示，給予DSS灌胃各組小鼠DAI評分增加，再給予柚皮素治療后，DAI評分顯著降低，且其作用效果與潑尼松龍類似。潑尼松龍是潰瘍性結腸炎的標準臨床治療方法，表明柚皮素對潰瘍性結腸炎具有治療作用。同時，本研究對柚皮素治療潰瘍性結腸炎的作用機制進行探討。

研究證實，miRNA與炎癥和免疫系統(tǒng)功能有關。在上皮細胞中，脂多糖下調(diào)miR-30a-3p，miR-30a-3p模擬物顯著抑制了Ⅱ型上皮細胞凋亡[16]。同時，miR-30a-3p過表達也可以改善膿毒癥誘導的身體損傷[17]。本研究結果顯示，柚皮素能促進結腸組織中miR-30a-3p表達。最新研究表明，在PTEN/PI3K/AKT信號通路中，PTEN能編碼一種具有蛋白質(zhì)和脂質(zhì)磷酸酶活性的多功能蛋白，干擾PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導，導致細胞周期G期的阻斷[18-19]。當缺乏PTEN表達時，PI3K被激活后可催化3,4,5 -磷酸磷脂酰肌醇三磷酸磷酸化，然后激活Akt，抑制細胞凋亡并促進細胞增殖，失去對細胞生長的控制[20]。既往研究報道，miRNA通過直接下調(diào)PTEN調(diào)控PI3K/Akt信號通路，從而促進Akt磷酸化，影響Th2細胞因子IL-4、IL-8、IL-10的表達，打破Th1/Th2細胞因子平衡，導致促炎細胞因子的產(chǎn)生減少，提示miRNA與PTEN/PI3K/Akt信號通路相關[21]。同時，結腸細胞凋亡增加可以加重潰瘍性結腸炎小鼠的病情，而炎癥反應可以促進細胞凋亡[22-24]。本研究結果顯示，過表達的miR-30a-3p抑制PTEN的表達，促進PI3K和Akt表達，從而抑制Caspase-3表達。

4 結論

柚皮素通過促進miR-30a-3p表達，負調(diào)控PTEN表達，減輕炎癥因子誘導的細胞凋亡，改善潰瘍性結腸炎癥狀，為柚皮素治療潰瘍性結腸炎提供了理論依據(jù)，也為潰瘍性結腸炎的機制研究提供了實驗數(shù)據(jù)。