盧燕梅

摘 要 探討2019年人教版高中生物學(xué)教材《選擇性必修3.生物技術(shù)與工程》“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”探究實(shí)驗(yàn)中的引物設(shè)計(jì)、退火溫度估算、延伸時(shí)間計(jì)算、電泳介質(zhì)選擇、緩沖液作用等內(nèi)容。

關(guān)鍵詞 PCR 電泳 生物學(xué)教學(xué)

中圖分類號(hào)Q-49

文獻(xiàn)標(biāo)志碼E

2019年人教版高中生物學(xué)教材《選擇性必修3.生物技術(shù)與工程》（以下簡(jiǎn)稱“新教材”）中的“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”探究實(shí)驗(yàn)在老版教材（2007年版）的基礎(chǔ)上增加了PCR實(shí)驗(yàn)及電泳鑒定的方法等步驟。由于高中一線教師和學(xué)生很少能有實(shí)際操作的機(jī)會(huì)，且對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的具體細(xì)節(jié)及對(duì)應(yīng)原理了解有限，因此在教學(xué)及學(xué)習(xí)過(guò)程中存在各式各樣的疑惑。下文將結(jié)合文獻(xiàn)資料和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)該實(shí)驗(yàn)中常見的問(wèn)題進(jìn)行剖析。

1 設(shè)計(jì)引物的原則

特異性引物的設(shè)計(jì)理論上應(yīng)依據(jù)目的基因兩端的己知堿基序列，遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行。但實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，DNA的部分區(qū)域是不能進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的。在科研過(guò)程中，研究者經(jīng)常利用親緣關(guān)系較近的生物的保守序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增未知序列。因此，實(shí)際操作中設(shè)計(jì)的引物不能夠與模板完全配對(duì)。有效引物的獲得應(yīng)遵循以下原則：

①應(yīng)與同一基因組中其他核酸序列無(wú)明顯相似。

②引物長(zhǎng)度一般設(shè)計(jì)在20-25 bp。以引物長(zhǎng)度為20 bp為例，420 ≈1.099 5xl0 12，己遠(yuǎn)大于哺乳動(dòng)物單倍體基因組3x109 bp，因此可防止引物的隨機(jī)結(jié)合。

③（G+C）堿基含量占比40%-60%為宜。（G+C）堿基含量會(huì)影響退火溫度，最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，應(yīng)避免出現(xiàn)相同堿基多次連續(xù)排列。

④引物本身避免出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（避免4 bp以上的回文序列）以及兩條引物間形成較長(zhǎng)的互補(bǔ)配對(duì)情況。若是引物間3’端反向互補(bǔ)，則會(huì)增大引物二聚體的形成概率，降低特異性擴(kuò)增的效率。

⑤引物3’端的末尾堿基需完全與目標(biāo)序列配對(duì)，否則易導(dǎo)致退火失敗。

⑥引物的3’端的堿基最好設(shè)計(jì)成T或G。因?yàn)門aq DNA聚合酶（以下簡(jiǎn)稱Taq酶）對(duì)T或G比對(duì)C或A的識(shí)別度（親和性）更高。

⑦引物中帶有合適的酶切位點(diǎn)。有些擴(kuò)增出的目的基因后續(xù)要進(jìn)行酶切分析或連接到載體上。

通常實(shí)驗(yàn)室的引物設(shè)計(jì)借助引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行，如Primer Premier （6.0版）、Oligo 7、NCBI的primerBlast，可按照實(shí)驗(yàn)者需求進(jìn)行設(shè)計(jì)。

2 估算退火溫度的方式

退火溫度的設(shè)定是影響PCR是否成功的重要因素之一。新老教材的PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程將退火溫度均設(shè)置為55℃，使得眾多教師與學(xué)生誤認(rèn)為退火溫度只能是55℃。由于反應(yīng)體系中引物濃度遠(yuǎn)高于模板濃度，且模板DNA遠(yuǎn)比引物復(fù)雜，因此退火過(guò)程是由引物驅(qū)動(dòng)的。針對(duì)不同的引物，退火溫度要依據(jù)其長(zhǎng)度、堿基組成等條件來(lái)設(shè)定。一般情況下，可借助以下公式預(yù)判退火溫度：Tm=4（G+C）+2（A+T）（其中Tm即解鏈溫度，是指在此溫度下DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈一半）。為保證引物和模板的有效結(jié)合，退火溫度需低于計(jì)算出的Tm值，一般情況下退火溫度為Tm - 5℃因此，若退火溫度設(shè)置過(guò)高，則引物與模板鏈不易結(jié)合，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法獲得特異性產(chǎn)物或特異性產(chǎn)物量過(guò)低;若溫度過(guò)低，則又會(huì)增加引物與模板非目的片段隨機(jī)結(jié)合概率，而獲得非特異性產(chǎn)物。

3 計(jì)算延伸時(shí)間的規(guī)律

延伸溫度取決于使用的Taq酶的最適溫度，一般為70-75℃，通常設(shè)定為72℃。實(shí)際實(shí)驗(yàn)的延伸時(shí)間需參考設(shè)定延伸溫度下Taq酶活性和目的片段的長(zhǎng)度。目前，眾多實(shí)驗(yàn)室使用的Taq酶在72C下堿基延伸速率可達(dá)到1 kb/min。因此，當(dāng)擴(kuò)增大小1 kb及以內(nèi)的DNA片段時(shí)可延伸1 min;當(dāng)擴(kuò)增大小2 kb及以內(nèi)的DNA片段時(shí)延伸2 min，以此類推。而當(dāng)擴(kuò)增片段小于150 bp，則可省略延伸步驟，因?yàn)樵谕嘶饻囟认碌腡aq酶活性己足以完成目的序列的延伸。通常在最后一輪循環(huán)完成后，實(shí)驗(yàn)應(yīng)將反應(yīng)體系在72C下保溫5 min，以保證所有片段的延伸完成。

4 選用瓊脂糖的原因

瓊脂糖（圖1）是由D-吡喃半乳糖和3，6-脫水一L-吡喃半乳糖兩個(gè)單位交替組成的線性多糖聚合物。D-半乳糖單位以B取向與3，6-脫水-L-半乳糖單位的C4位相連，后一單位以α取向與D-半乳糖單位C3位相連。瓊脂糖因不含負(fù)電荷的硫酸根和羧基，在電泳過(guò)程中不會(huì)吸附離子，因此是電泳實(shí)驗(yàn)的良好介質(zhì)。因瓊脂糖對(duì)DNA片段的分辨能力由其濃度決定，在實(shí)際操作中要注意對(duì)瓊脂糖濃度的選擇。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2-50 kb，凝膠濃度的高低會(huì)影響最終形成膠體的孔隙大小，濃度越低，孔隙越大，其分辨能力就越弱;反之則孔隙減小，分辨力增強(qiáng)（表1）。

電泳實(shí)驗(yàn)使用的瓊脂糖與微生物實(shí)驗(yàn)中制備培養(yǎng)基的瓊脂同樣具有凝固作用，二者是否為同一物質(zhì)在不同實(shí)驗(yàn)中的表述？對(duì)瓊脂進(jìn)行化學(xué)分析，可分離出瓊脂糖和瓊脂膠兩個(gè)組分。瓊脂糖是瓊脂的主要組分，而瓊脂膠又是瓊脂糖的衍生物，是由丙酮酸基、甲氧基、硫酸基等不同程度地取代瓊脂糖上的羥基的產(chǎn)物，如3-D-半乳糖殘基C6被硫酸酯化（圖2）。因此，二者并不是同一種物質(zhì)。而正因瓊脂帶有電荷，不如瓊脂糖適合作為電泳介質(zhì)。

5 添加緩沖液的目的

5.1 擴(kuò)增緩沖液

擴(kuò)增緩沖液為PCR反應(yīng)體系提供所需的pH環(huán)境和添加劑。目前最常用的緩沖液是10-50 mmol/L的Tris-HCl，能夠?yàn)檎麄€(gè)反應(yīng)體系提供適宜的pH。添加劑包括Mg2+、K+、Cl、Taq酶保護(hù)劑等（表2）。擴(kuò)增緩沖液有不同的濃縮倍數(shù)，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)行稀釋。以10倍濃縮（10X）的擴(kuò)增緩沖液為例，若整個(gè)反應(yīng)體系總體積為50 uL，則擴(kuò)增緩沖液只需添加5 uL。

5.2 電泳緩沖液

電泳緩沖液在維系電泳體系pH的同時(shí)，因帶有一定的導(dǎo)電能力而影響DNA的遷移速率。實(shí)驗(yàn)室中最常見的DNA電泳緩沖液有TAE與TBE，二者各有優(yōu)勢(shì)，前者可用于做切膠回收實(shí)驗(yàn)，后者可承受更長(zhǎng)時(shí)間的電泳。實(shí)驗(yàn)室通常一次性配制一定量（常以升為單位）的儲(chǔ)存液，待到使用時(shí)將儲(chǔ)存液用超純水稀釋一定倍數(shù)即可。以TAE緩沖液為例分析其各成分作用，見表3。

5.3 上樣緩沖液

上樣緩沖液又稱載樣緩沖液，實(shí)驗(yàn)時(shí)需將其與待測(cè)產(chǎn)物混合。因緩沖液中含有甘油，使得混合物的密度大于電泳緩沖液，點(diǎn)樣時(shí)便會(huì)沉積在點(diǎn)樣孔的底部。此外，上樣緩沖液因含有溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF而呈深藍(lán)色，可以幫助實(shí)驗(yàn)者觀察DNA所處的位置，防止因電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致DNA跑出凝膠。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱圣庚，徐長(zhǎng)法.生物化學(xué)（下冊(cè)）[M].北京：高等教育出版社，2016.

[2]朱圣庚，徐長(zhǎng)法.生物化學(xué)（上冊(cè)）[M].北京：高等教育出版社，2016.

[3]朱玉賢，李毅，鄭曉峰等.現(xiàn)代分子生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2019.

[4]王廷華，劉佳，夏慶杰.PCR理論與技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2013.