高 宇，孫建榮，鄧 超，賈立群

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029；2.中日友好醫(yī)院，北京，100029）

化療相關(guān)腹瀉（chemotherapy-induced diarrhea，CID）主要指應(yīng)用5 氟尿嘧啶（5-FU）和伊立替康等化療藥物時或治療后出現(xiàn)的腹瀉，是臨床常見的化療不良反應(yīng)，不僅嚴重影響治療的療效和完成，嚴重者甚至?xí)霈F(xiàn)脫水和電解質(zhì)紊亂等危及生命的癥狀，給腫瘤患者帶來巨大的健康和經(jīng)濟損害［1，2］。文獻顯示，腫瘤患者因化療引起腹瀉（3～4 級）的發(fā)生率為10%～20%，應(yīng)用5 氟尿嘧啶（5-FU）和伊立替康的腹瀉發(fā)生率尤其高［3］。伊立替康是喜樹堿的半合成衍生物，是一種無活性前體藥物，經(jīng)肝臟代謝后進入腸道，經(jīng)β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化為可以損傷腸道的活性產(chǎn)物SN-38，引起遲發(fā)性腹瀉［4］。目前臨床常規(guī)治療為奧曲肽、洛哌丁胺、思密達等抑制腸蠕動，保護腸黏膜。中藥作為防治CID 的手段之一，已通過前期臨床試驗和基礎(chǔ)實驗初步證實了其有效性。生姜瀉心湯出自《傷寒論》，由甘草、黨參、干姜、半夏、黃芩、黃連、生姜、大棗組成，主治水飲食滯互結(jié)，胃中不和所致的“心下痞硬，干噫食臭，脅下有水氣，腹中雷鳴，下利者［5］?！北菊n題團隊歷經(jīng)10 余年研究，前期臨床觀察顯示生姜瀉心湯可顯著降低伊立替康CID 的發(fā)生率，尤其對于UGT1A1基因突變的腹瀉高危人群［6，7］；同時，依托國家自然科學(xué)基金項目對其機理進行了探索，發(fā)現(xiàn)生姜瀉心湯可通過促進腸細胞增殖、抑制腸細胞凋亡等機制改善伊立替康所致的腸道黏膜損傷［8-10］。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略，構(gòu)建“藥物成分-作用靶點-作用通路”多維網(wǎng)絡(luò)，探討其治療CID 的作用機制，實現(xiàn)對中藥復(fù)方作用機制的預(yù)測和分析，為進一步開展基礎(chǔ)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選及作用靶點預(yù)測

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索半夏、大棗、黨參、甘草、干姜、黃連、此同時黃芩以及生姜的化合物成分［11］。成分篩選條件為口服生物利用度OB≥30%，藥物相似性DL≥0.18。將符合條件的化合物成分通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫進行成分的靶點預(yù)測。

1.2 化療相關(guān)腹瀉靶點查找

以“chemotherapy induced diarrhea”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫與NCBI 基因數(shù)據(jù)庫中進行人類基因檢索。其中GeneCards 的數(shù)據(jù)將Relevance score 進行中位值的篩選以獲得疾病相關(guān)性更高的靶點［12，13］。將兩個數(shù)據(jù)庫得到的檢索結(jié)果進行整合重后，建立CID 的預(yù)測靶點庫。

1.3 藥物-疾病靶點篩選與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)-PPI構(gòu)建

將篩選出的生姜瀉心湯的藥物靶點與CID 靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，交集得到的共有靶點作為藥物作用于疾病的預(yù)測靶點。藥物-化合物成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)采用Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建。

設(shè)置參數(shù)，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，可信度設(shè)置為>0.9，將生姜瀉心湯-CID 共有靶點輸入String 數(shù)據(jù)庫進行PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，得到PPI網(wǎng)絡(luò)［14］。

1.4 GO 富集分析和KEGG 富集分析

GO 數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology），將基因功能分成了3 個部分，分別是：細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）。使用用GO 數(shù)據(jù)庫，可以在CC、MF、BP 3 個層面上獲得目標基因在的富集，并對藥物疾病共有靶點進行KEGG 通路富集分析。引用String 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置校正P值<0.05，對項目進行篩選。條形圖和氣泡圖繪制使用R 3.6.3 軟件“clusterProfiler”，“enrichplot”，“ggplot2”包。根據(jù)富集基因數(shù)目降序排列，選取富集基因數(shù)目位居前列的生物學(xué)過程和通路作為本次研究的主要討論對象。

1.5 潛在作用靶點與關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在文本文件（txt 中）將生姜瀉心湯-CID 共同靶點均按照數(shù)據(jù)、屬性文件進行數(shù)據(jù)編排后，與參與CID 的20 條KEGG 通路共同輸入到Cytoscape 3.8.0 軟件中，構(gòu)建潛在作用靶點與KEGG 通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

1.6 分子對接

根據(jù)拓撲學(xué)參數(shù)獲得核心藥物成分，化合物的SDF 結(jié)構(gòu)可以從Pubchem 網(wǎng)站獲得，使用Open Ba?bel 2.3.2 軟件將SDF 文件轉(zhuǎn)化為PDB 文件。受體蛋白從Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫中檢索獲得，利用PYMOL 2.3.4 軟件對受體蛋白進行去水、去配體等操作，對受體蛋白進行加氫、平衡電荷等修飾采用AutoDockTools 軟件，用Grid 程序下的Grid Box 命令打開Grid Option 工具對每個受體蛋白進行處理，配體結(jié)合口袋的大小由各個方向上格點的數(shù)目和格點間距共同決定，因此調(diào)整各個蛋白每個方向上格點的數(shù)目、結(jié)合口袋的中心以及格點的間距，采用Autodock vina 1.1.2 進行半柔性對接。

2 結(jié)果

2.1 生姜瀉心湯的有效成分

設(shè)置OB%≥30%、DL≥0.18 為篩選條件，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中匯總?cè)ブ氐玫剑捍髼椨?9 個化合物成分，199 個靶點；半夏獲得13 個化合物成分，93個靶點；黃芩獲得36 個化合物成分，110 個靶點；黨參獲得21 個化合物成分，106 個靶點；甘草獲得93個化合物成分，215 個靶點；干姜獲得5 個化合物成分，43 個靶點；黃連獲得14 個化合物成分，175 個靶點；半夏獲得13 個化合物成分，93 個靶點；生姜獲得5 個化合物成分，54 個靶點。將化學(xué)成分整理去重后，共得到化合物成分229 個，其中OB%排名前20的成分信息如下（表1）。去重后獲得上述化學(xué)成分的有效靶點276 個。

表1 生姜瀉心湯活性化合物信息表Tab 1 Active components of Shengjiang Xiexin decoction

2.2 化療相關(guān)腹瀉靶點查找

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫，NCBI 基因數(shù)據(jù)庫進行人類基因檢索。其中GeneCards 的數(shù)據(jù)將Relevance score 進行中位值的篩選以獲得相關(guān)性更強的靶點。在NCBI 數(shù)據(jù)庫檢索獲得39 條基因，在GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)基因1 761 條。將這2 個數(shù)據(jù)庫的基因合并刪重之后，得到1 764 個相關(guān)基因，建立CID 的預(yù)測靶點庫。疾病基因還需和藥物作用靶點取交集，進而獲得藥物對疾病的潛在治療靶點。

將“2.1”中篩選出的276 個藥物靶點與本次篩選得到的1 764 個疾病靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，獲得173 個共有靶點，作為藥物作用于疾病的預(yù)測靶點，見圖1。

圖1 藥物?疾病共有靶點篩選韋恩圖Fig 1 Venny map of intersection target of drug-disease

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析及中藥-成分-疾病-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

筆者以篩選的成分、治療疾病以及作用靶點為基礎(chǔ)，構(gòu)建了成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，采用cytoscape 3.8.0 軟件得到中藥成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。這樣的構(gòu)建可以更好的理解藥物成分，疾病靶點之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系。將生物種類設(shè)定為“Ho?mo sapiens”，可信度設(shè)置為>0.9，將韋恩圖得到的173 個藥物疾病共有靶點輸入String 數(shù)據(jù)庫進行PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。得到PPI 網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)中有173個節(jié)點，794 條邊，平均度值為9.18。圖3 為string 網(wǎng)站導(dǎo)出的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入cytoscape 軟件繪制的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，其中節(jié)點顏色和大小根據(jù)度值調(diào)整，越大，顏色越深，度值越大，線的粗細，從粗到細表示edge betweenness 從大到小。

圖2 中藥成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of active components-effective targets

圖3 Cytoscape 繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram analyzed with Cytoscape

2.4 靶點功能通路富集分析

將藥物疾病共有靶點進行GO 的BP、MF、CC富集，設(shè)定校正P值≤0.05，引用String 數(shù)據(jù)庫，篩選后總共富集到79 項細胞組分，2 427 條生物過程，168 項分子功能。共同作用靶點在細胞組成（CC）中主要富集條目為膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等。共同作用靶點在分子功能（MF）中主要富集條目為細胞因子受體結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子活性等。共同作用靶點在生物過程（BP）中，主要富集條目為脂多糖應(yīng)答、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對細菌來源分子的反應(yīng)、化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)等。繪制柱狀圖和氣泡圖使用R3.6.3 包，見圖4、5。

圖4 GO 富集分析（柱狀圖）Fig 4 GO enrichment analysis diagram（bar charts）

將生姜瀉心湯-CID 共有靶點進行KEGG 通路富集分析，總共富集到169 條信號通路。使用R 3.6.3，安裝并引用clusterProfiler 包后，進行氣泡圖繪制，見圖6。具體信息見“KEGG 富集表”主要涉及Toll 樣受體信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、乙型肝炎（Hepatitise B）信號通路、A 型流感病毒（Inlfuenza A）通路、小細胞肺癌相關(guān)通路等信號通路。將生姜瀉心湯-作用成分-化療相關(guān)腹瀉-信號通路-作用靶點網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0 進行通路網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。更直觀地展示中藥活性成分在治療CID 過程中的多成分-多靶點的作用特點，見圖7。

圖5 GO 富集分析（氣泡圖）Fig 5 GO enrichment analysis（bubble diagram）

圖6 KEGG 富集分析（氣泡圖）Fig 6 KEGG enrichment analysis（bubble diagram）

圖7 中藥-成分-疾病-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig 7 Drugs-ingredients-disease-pathway-target network diagram

2.5 拓撲分析獲得疾病核心靶點

將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.8.0［15］中，設(shè)置de?gree，betweenness centrality，average shortest path length 和closeness centrality 參數(shù)，采用Network Analyzer 工具進行拓撲分析。按degree 值排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點，總共篩選出個58 關(guān)鍵靶點，20 個核心靶點分別為STAT3、AKT1、MAPK3、JUN、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14、MAPK8、APP、EGFR、VEGFA、FOS、ESR1、CCND1、CTNNB1、CXCL8、EGF、MYC、RB1。將前20 個關(guān)鍵靶點采用R 3.6.3 進行圖片繪制，橫坐標為每個靶點的度值，見圖8。

圖8 關(guān)鍵靶點篩選Fig 8 Selection of key targets

2.6 中藥復(fù)方的關(guān)鍵成分篩選

采用cytoscape 3.8.0，將成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖進行拓撲分析。將成分進行degree 的排序，將大于平均度值的成分篩選出來作為關(guān)鍵成分（degree 值越高成分越重要），見表2。

表2 關(guān)鍵成分信息表Tab 2 Key components

續(xù)表

2.7 分子對接

選取度值排名靠前的21 個化合物與排名前10的關(guān)鍵基因進行對接，結(jié)果顯示結(jié)合能（affinity）均小于?5 kcal/mol，說明受體與配體可以自發(fā)結(jié)合，提示有較強的結(jié)合活性。將受體蛋白與配體分別進行分子對接，采用AutoDock Vina 1.1.2 軟件。親和力結(jié)果以親和能（affinity）形式表示，親核能值越高表示結(jié)合越差，能值越低，二者的結(jié)合效果越好。親和能打分綜合氫鍵、排斥作用、疏水作用、復(fù)合物空間效果。挑選代表性結(jié)合能打分及對接參數(shù)如表3 所示。

表3 生姜瀉心湯中活性成分與關(guān)鍵靶點結(jié)合能預(yù)測Tab 3 Binding capability prediction of active ingredients of Shengjiang Xiexin decoction and the key targets

受體蛋白與配體小分子之間均可形成氫鍵相互作用和疏水相互作用，說明活性成分與靶蛋白具有較強的親和力，且結(jié)合體構(gòu)象穩(wěn)定，見圖9a～j。

圖9 分子對接示意圖Fig 9 Molecular docking visualization

3 討論

CID 臨床發(fā)生率在50%～80%［16］，給患者的治療和生活質(zhì)量帶來了嚴重的影響。細胞毒性化療藥物可抑制癌細胞的增殖，但同時也會對其他組織和器官產(chǎn)生毒性和副作用。有效防治CID 是亟待解決的關(guān)鍵臨床問題。目前研究發(fā)現(xiàn)CID 發(fā)生的機制涉及腸道炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等［17，18］。

CID 屬于中醫(yī)“泄瀉”、“下利”范疇，目前臨床對CID 的病機認識多為寒濕下注，虛寒凝結(jié)，寒熱錯雜，多責之本虛標實。惡性腫瘤患者病程較長，受癌毒侵襲日久后耗傷正氣，氣血陰陽失調(diào)，臟腑功能失常，故為本虛；化療藥毒多傷及正氣，在殺傷腫瘤時對患者自身尤其是胃腸道的損害極大，故見標實。常見泄瀉選方有用生姜瀉心湯、參苓白術(shù)散、四神丸、藿香正氣丸等。泄瀉病位在腸道，伊立替康引起的腸間質(zhì)水腫就是中醫(yī)說的水蓄三焦，故治療上以調(diào)和中焦脾胃為主，配合采用溫中化飲、健脾燥濕等治法，多采用生姜瀉心湯、甘草瀉心湯等。生姜瀉心湯作為《傷寒論》中的三瀉心湯方之一，在臨床應(yīng)用廣泛，療效顯著，造福眾多患者。CID 的基本病機基本病機水飲郁熱，寒熱錯雜?！爸T嘔吐酸，暴注下迫，皆屬于熱”，所以用黃芩、黃連清熱，治法上亦應(yīng)重點考慮“疏利”。水飲本是陰邪，所以要用半夏、干姜與大劑量生姜溫化水飲，如“病痰飲者當以溫藥和之”，水飲阻滯氣機，郁而化熱，所以出現(xiàn)“腹中雷鳴自下利”，故以黃芩黃連去清除郁熱。再結(jié)合臨床分析，如伊立替康引起的腹瀉臨床常見腹中雷鳴癥狀，患者經(jīng)常自訴腹中腸鳴，腹瀉稀水樣便，便是熱迫水飲的表現(xiàn)，并見口苦咽干，屬于肝經(jīng)郁熱。腹瀉伴有肛門墜脹，于馬桶上久坐不起，“濕性重著”、“濕為陰邪，易襲陰位”，肛門墜脹是正氣不足、濕邪下注的表現(xiàn)，肛門墜重是水濕，故采用半夏、生姜、干姜。參棗草共奏補虛之效，與李中梓止瀉之“甘緩法”相合。

前期的臨床和實驗研究已經(jīng)證實生姜瀉心湯具有降低伊立替康腸毒性的作用，并發(fā)現(xiàn)與其抑制腸粘膜細胞凋亡、促進腸干細胞增殖及改變腸道細菌分泌的代謝酶活性相關(guān)［19］。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，分析生姜瀉心湯的有效成分及作用靶點，為探索生姜瀉心湯治療化療相關(guān)性腹瀉的機制研究提供理論基礎(chǔ)。

本研究顯示，生姜瀉心湯的有效成分作用靶點276 個，與CID 相關(guān)的作用靶點173 個。木犀草素（luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、表兒茶素（ent-Epicatechin）、松柏苷（coniferin）、兒茶素（-）-cate?chin、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、谷甾醇（sitosterol）等為關(guān)鍵的有效化合物。文獻表明木犀草素屬于類黃酮類，具有抗炎作用，在調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)和治療慢性炎癥性腸病中起著重要作用，可以減少小腸內(nèi)容物的體積和重量，從而發(fā)揮止瀉作用［18，20］。表兒茶素可以調(diào)節(jié)K+、Ca2+通道［21］，：表兒茶素可能減少炎癥因子TNF-α、IL-1 和IL-6，抑制LPS 誘導(dǎo)的細胞炎癥反應(yīng)，起到抗炎作用［22］。槲皮素能顯著降低TLR2 和TLR4 mRNA 和蛋白水平，降低MyD88 蛋白表達水平，進一步降低炎性因子TNF-α 的釋放量，保護大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞免受細胞炎性損害［23］。研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)生姜瀉心湯可能主要是通過上述化合物發(fā)揮治療CID 的作用。

從蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果來看，STAT3、AKT1、MAPK3、JUN、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK14、MAPK8、APP、EGFR 等是生姜瀉心湯治療化療相關(guān)性腹瀉的關(guān)鍵靶點。研究表明，促炎癥細胞因子通過激活STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起腸黏膜屏障的受損，導(dǎo)致腹瀉發(fā)生［24］。炎性因子IL-6 的釋放導(dǎo)致腸道細菌移位及內(nèi)毒素的吸收，加重腸黏膜屏障的損傷，導(dǎo)致腹瀉加重［25］。AKT1 是調(diào)節(jié)免疫、降低炎癥、抑制癌癥發(fā)生的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)節(jié)點［26］。

GO 功能富集分析結(jié)果主要與DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、脂多糖應(yīng)答、化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程相關(guān)。在靶點基因的KEGG富集分析中，可以發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、乙型肝炎信號通路高度富集，與CID 密切相關(guān)。Toll 樣受體是一種模式識別受體，通過識別病原微生物表達的病原相關(guān)分子結(jié)構(gòu)激活相關(guān)信號通路誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而清除入侵的病原微生物［27，28］。TLR 還可以在腸上皮細胞表面表達，可識別并結(jié)合微生物及其代謝產(chǎn)物。目前，在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10 多個TLR 家族成員。其中，TLR4 的表達與伊立替康遲發(fā)性腹瀉的發(fā)生密切相關(guān)，TLR4 通過促進炎癥因子表達、抑制腸上皮TJs 表達而破壞腸道屏障功能［29，30］。TLR4-MyD88 依賴性信號通路的下游可以轉(zhuǎn)導(dǎo)c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal ki?nase，JNK）JNK 信號通路主要參與細胞增殖、分化、凋亡的調(diào)控。抑制JNK 表達可促進腸上皮TJs的表達并降低腸道通透性［31］。

分子對接采用21 個藥物活性成分與10 個靶點進行分子對接，結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，可形成氫鍵，篩選出的藥物成分和靶點結(jié)合性較高，驗證了運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對生姜瀉心湯治療CID 作用機制進行初步探討的可靠性。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接相結(jié)合的方法，預(yù)測生姜瀉心湯治療CID 的作用機制，發(fā)現(xiàn)173 個藥物與疾病的共同靶點，生姜瀉心湯治療CID 可能是通過STAT3、AKT1、MAPK3、JUN、MAPK1、RELA、IL6 等蛋白作用，發(fā)生DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、脂多糖應(yīng)答、化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程，并主要富集在Toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、乙型肝炎（hepatitise B）信號通路、A 型流感病毒（in?fuenza A）通路、小細胞肺癌相關(guān)通路等信號通路上，發(fā)揮抗炎和修復(fù)屏障等作用。本研究對生姜瀉心湯為進一步研究提供了重要參考，對藥物作用機理進行了初步探索。但本研究僅作為一種預(yù)測，是在分子機制層面進行的預(yù)測探討，根據(jù)研究結(jié)果中排名靠前的通路，并結(jié)合參考文獻，展開基礎(chǔ)研究進行進一步驗證其具體的作用機理。

作者貢獻度說明：

高宇：課題實施、撰寫全文等工作；賈立群：提出論文主題，設(shè)計實施方案，論文終稿審閱；孫建榮：網(wǎng)絡(luò)藥理、分子對接數(shù)據(jù)分析及整理；鄧超：圖表整理及文章修改。