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      電針對(duì)IBS-D模型大鼠結(jié)腸組織中PAR-2表達(dá)的影響*

      2022-07-27 02:36:58鄭淑霞許金森陳苑平薩喆燕潘曉華
      云南中醫(yī)中藥雜志 2022年7期
      關(guān)鍵詞:造模電針結(jié)腸

      鄭淑霞,許金森,陳苑平,陳 柯,薩喆燕,潘曉華

      (福建省中醫(yī)藥科學(xué)院經(jīng)絡(luò)研究所/福建省經(jīng)絡(luò)感傳重點(diǎn)研究室,福建 福州 350003)

      腹瀉型腸易激綜合征(diarrhoeal irritable bowel syndrome,IBS-D)是臨床最為常見(jiàn)的功能性胃腸病之一,因其癥狀遷延不愈,復(fù)發(fā)率高,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[1-2]。已有臨床和實(shí)驗(yàn)研究[3-5]證實(shí),針刺對(duì)IBS-D有較好的治療效果,能顯著改善IBS-D患者腹痛、腹瀉等腸道癥狀,恢復(fù)腸道功能。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)PAR-2介導(dǎo)的信號(hào)通路在IBS的發(fā)病機(jī)制中起到重要影響,不僅參與胃腸道的運(yùn)動(dòng)功能,還可調(diào)節(jié)內(nèi)臟的敏感程度,且越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)PAR-2在腸道黏膜通透性中亦起到重要作用。然而針刺對(duì)IBS-D腸道功能的調(diào)節(jié)作用是否與PAR-2有關(guān),目前尚未有深入研究。因此本研究觀察了IBS-D模型大鼠結(jié)腸組織PAR-2 mRNA及蛋白表達(dá)的變化,探討電針干預(yù)IBS-D的可能機(jī)制,為電針治療IBS-D提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 動(dòng)物 健康成年的雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量(250±20)g,由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司動(dòng)物提供(許可證號(hào):SCXK(滬)2018-0006)。適應(yīng)性飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心7 d后分組飼養(yǎng),溫度為(23~26)℃,相對(duì)濕度為50%~70%。

      1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 番瀉葉生藥(亳州市華鑫中藥飲片科技有限公司),液體石蠟(運(yùn)加牌,黑龍江省運(yùn)加醫(yī)療科技有限公司),AG RNAex Pro RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR? Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司),PAR-2一抗(英國(guó) Abcam公司),GAPDH一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(H+L)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),8FR導(dǎo)尿管(事達(dá)牌,湛江市事達(dá)實(shí)業(yè)有限公司),2 mL注射器(康友牌,江蘇康友醫(yī)用器械有限公司),電子秤(福建福日電子股份有限公司),R407小動(dòng)物呼吸麻醉系統(tǒng)(瑞沃德生命科技有限公司),異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司),SDZ-Ⅱ型電針儀(華佗牌,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司),0.25 mm×13 mm無(wú)菌針灸針(華成牌,蘇州東邦醫(yī)療器械有限公司),NANODROP RNA質(zhì)量檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司),Veriti梯度PCR儀(美國(guó)ABI公司),ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司),冷凍高通量組織研磨儀(浙江美壁儀器有限公司)。

      1.3 分組與造模 32只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分成對(duì)照組、對(duì)照電針組、模型組及模型電針組,每組8只。對(duì)照組、對(duì)照電針組大鼠正常喂養(yǎng),余下2組則需進(jìn)行2w的IBS-D造模處理。參照Williams等[6]的方法進(jìn)行改進(jìn),采用慢性束縛應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌胃的方法建立IBS-D大鼠模型,并參照趙妍等[7]的方法制備0.3 g/mL的番瀉葉煎劑。造模時(shí)先給予番瀉葉煎劑(0.3 g/mL),并按照10 mL/kg的給藥劑量灌胃。灌服番瀉葉煎劑后,將大鼠裝進(jìn)自制的固定器中,限制其無(wú)法進(jìn)行自如活動(dòng),持續(xù)時(shí)長(zhǎng)為1h,每日1次,持續(xù)2w。以模型組大鼠腹瀉指數(shù)與大便Bristol評(píng)分、直結(jié)腸擴(kuò)張(colorectal distension,CRD)容量閾值與空白組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

      1.4 干預(yù)方法 對(duì)照電針組和模型電針組在造模成功后對(duì)大鼠的足三里穴進(jìn)行電針干預(yù),將大鼠固定在自制固定器內(nèi),使其不亂跑亂動(dòng),參照實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》,選取大鼠的足三里穴。選用規(guī)格為0.25 mm×13 mm的毫針直刺,深度約為5 mm,并接上電針儀,選用疏密波,頻率2 Hz,強(qiáng)度為1~2 mA,以大鼠下肢出現(xiàn)輕微抖動(dòng)且不嘶叫為度,留針20 min,每日1次,持續(xù)7d。

      1.5 觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

      1.5.1 一般情況 觀察大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤度以及體重增長(zhǎng)等情況。

      1.5.2 腹瀉情況 在大鼠造模前后以及干預(yù)后,對(duì)所有大鼠進(jìn)行腹瀉指數(shù)的測(cè)算。腹瀉指數(shù)測(cè)定時(shí)在鼠籠內(nèi)墊上濾紙,定時(shí)觀察大鼠排便情況,如有稀便污跡沾染濾紙則需更換濾紙,并及時(shí)記錄濾紙的污跡面積。持續(xù)觀察5h后,統(tǒng)計(jì)大鼠排稀便的數(shù)量及腹瀉情況,再根據(jù)公式計(jì)算每只大鼠的腹瀉指數(shù)[8]。

      腹瀉指數(shù)=稀便率(每只大鼠的稀便數(shù)/總便數(shù))×稀便級(jí)(每只大鼠的稀便級(jí)數(shù)總和/稀便數(shù))。

      稀便級(jí)數(shù)分級(jí)[4]:以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級(jí),分為4級(jí):1級(jí)為污染直徑<1 cm,2級(jí)污染直徑1.0~1.9 cm,3級(jí)污染直徑2~3 cm,4級(jí)污染直徑>3 cm。統(tǒng)計(jì)每個(gè)大鼠排便的總數(shù),再統(tǒng)計(jì)大鼠排稀便的總數(shù),并逐一測(cè)定每堆稀便的級(jí)數(shù),然后參照公式算出腹瀉率、稀便級(jí)以及腹瀉指數(shù)。測(cè)量污染直徑時(shí),如果糞便形狀大致為圓形,則可以直接量直徑;若糞便形狀為橢圓形或較不規(guī)則時(shí),則測(cè)量其最長(zhǎng)距離和近似圓的直徑,并將二者相加除以2,即為最后的直徑。

      Bristol評(píng)分:參照Bristol分型積分[9],對(duì)大鼠的糞便形態(tài)逐一進(jìn)行評(píng)分,統(tǒng)計(jì)后取積分的平均值。

      1.5.3 內(nèi)臟敏感性評(píng)價(jià) 在造模前、造模后及干預(yù)后,先將大鼠禁食12 h,將所有大鼠逐個(gè)放入小動(dòng)物呼吸麻醉誘導(dǎo)盒內(nèi),使其吸入異氟烷麻醉。待其麻醉后將帶有球囊的8FR導(dǎo)尿管插入大鼠肛門(mén)內(nèi),導(dǎo)尿管插入深度為4.5 cm,隨后用膠帶將其纏在大鼠尾巴上固定。將大鼠放入規(guī)格為200 mm×80 mm×80 mm的透明固定盒中,并將含有溫生理鹽水的2 mL注射器接入導(dǎo)尿管尾部,待大鼠完全清醒后盡快檢測(cè)大鼠的內(nèi)臟敏感性。測(cè)量結(jié)直腸擴(kuò)張時(shí),緩慢向球囊內(nèi)注溫生理鹽水,使球囊內(nèi)的壓力逐漸增高,記錄大鼠出現(xiàn)腹壁收縮反應(yīng)及腹部、臀部抬高并抬離地面時(shí)的容量閾值,需重復(fù)3次該操作,并取平均值。

      1.5.4 熒光定量 PCR法檢測(cè)結(jié)腸組織PAR-2 mRNA的表達(dá):稱(chēng)取大鼠自肛門(mén)上6 cm處的結(jié)腸組織50~100 mg,剪碎,放入低溫研磨機(jī)中進(jìn)行組織研磨,用AG RNAex Pro RNA提取試劑盒提取結(jié)腸組織總RNA。用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,采用SYBR? Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒提供的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:各基因?qū)?yīng)上下游引物(引物序列見(jiàn)表1)各0.4 μL,2×SYBR? Green Pro Taq HS Premix 10 μL,cDNA模板2.0 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,最后加RNase free water到20 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30s;95 ℃ 5s,60 ℃ 30s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,運(yùn)用2-△△Ct公式計(jì)算目標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

      表1 引物序列

      1.5.5 Western blot法檢測(cè)結(jié)腸組織 PAR-2蛋白相對(duì)表達(dá)量:稱(chēng)取大鼠自肛門(mén)上6 cm處的結(jié)腸組織50~100 mg,加入適量的RIPA裂解液和適量的PMSF溶液,并放入研磨機(jī)內(nèi)進(jìn)行研磨、裂解。4℃、14000 rpm離心15 min,取上清液,得到總蛋白溶液。利用NANODROP RNA質(zhì)量檢測(cè)儀進(jìn)行總蛋白濃度測(cè)定,經(jīng)過(guò)電泳,通過(guò)轉(zhuǎn)膜裝置恒流轉(zhuǎn)膜,按照轉(zhuǎn)膜海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜(經(jīng)甲醇活化后)-濾紙-轉(zhuǎn)膜海綿的順序,持續(xù)轉(zhuǎn)膜45 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,TBST溶液中漂洗1 min,后再放入QuickBlock? Western封閉液內(nèi)進(jìn)行約30 min的封閉處理。加入經(jīng)抗體稀釋液稀釋的一抗(PAR-2抗體(兔單克隆抗體)按1∶10000稀釋?zhuān)琓RPV1抗體(兔多克隆抗體)按1∶1000稀釋?zhuān)珿APDH抗體按1∶1000稀釋),4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜后,用TBST溶液漂洗3遍,加入1∶20000稀釋的二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG)溶液中室溫孵育1 h,結(jié)束后用TBST溶液漂洗5遍,加入發(fā)光試劑盒中A液與B液,將膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)進(jìn)行顯影。顯現(xiàn)結(jié)束后得到的條帶用分析軟件進(jìn)行灰度值測(cè)定。以GAPDH為內(nèi)參蛋白,目的蛋白與GAPDH的比值為其相對(duì)表達(dá)量。

      2 結(jié)果

      2.1 各組大鼠一般情況比較 造模前,各組大鼠精神狀態(tài)良好,活潑好動(dòng),皮毛白凈順滑光澤,眼角口鼻干凈,耳廓呈淡粉色,大便干稀適中。造模結(jié)束后,與對(duì)照組相比,模型組和模型電針組的大鼠日常處于易激惹狀態(tài),弓身豎毛,躲避、畏懼,對(duì)周?chē)鷦?dòng)靜十分警惕,進(jìn)食量相對(duì)減少,毛色偏黃,較為粗糙無(wú)光澤,肛周及尾部可見(jiàn)明顯污穢附著。對(duì)各組大鼠在造模與電針干預(yù)前后體重值進(jìn)行比較,如表2所示,造模前各組體重比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);造模后,與對(duì)照組相比,對(duì)照電針組大鼠體重有所降低,差異不明顯,模型組與模型電針組的大鼠體重都明顯降低(P<0.01);電針干預(yù)后,與對(duì)照組相比,對(duì)照電針組大鼠體重有所降低,差異不明顯;與模型組相比,模型電針組大鼠的體重明顯高于模型組(P<0.01)。

      表2 各組大鼠體重值比較

      2.2 各組大鼠的腹瀉指數(shù)與大便Bristol評(píng)分比較 如表3所示,與對(duì)照組相比,模型組大鼠的腹瀉指數(shù)與Bristol評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P<0.01),而對(duì)照電針組大鼠的腹瀉指數(shù)、Bristol評(píng)分與對(duì)照組相比未見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與模型組比較,模型電針組大鼠的腹瀉指數(shù)、Bristol評(píng)分明顯低于模型組(P<0.01)。

      表3 各組大鼠大便的Bristol評(píng)分和腹瀉指數(shù)

      2.3 各組大鼠的內(nèi)臟敏感性評(píng)價(jià)比較 直結(jié)腸擴(kuò)張(colorectal distension,CRD)容量閾值包括腹部收縮、腹部抬高、臀部抬高的容量閾值,各組大鼠CRD容量閾值比較結(jié)果見(jiàn)表4。與對(duì)照組相比,對(duì)照電針組的腹部收縮、腹部抬高、臀部抬高的容量閾值比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組大鼠腹部收縮和腹部抬高的容量閾值明顯降低(P<0.01),模型組大鼠的臀部抬高閾值低于對(duì)照組(P<0.05);與模型組相比,電針組大鼠出現(xiàn)腹部收縮和腹部抬高的容量閾值明顯升高(P<0.05)。

      表4 容量閾值

      2.4 各組大鼠的腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)評(píng)分結(jié)果 如表5所示,與對(duì)照組相比,模型組大鼠在1 mL容量時(shí)的評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P<0.01)、在1.5 mL容量時(shí)的評(píng)分也高于對(duì)照組(P<0.05);與模型組比較,模型電針組的評(píng)分呈現(xiàn)降低趨勢(shì),電針組大鼠在1 mL容量時(shí)的評(píng)分低于模型組(P<0.05)、在1.5 mL容量時(shí)的評(píng)分也明顯低于模型組(P<0.01)。

      表5 腹壁撤反射評(píng)分

      2.5 各組大鼠結(jié)腸中PAR-2的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 如表6和圖1所示,與對(duì)照組相比,模型組大鼠PAR-2的mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯增多(P<0.01);與模型組相比,模型電針組大鼠的PAR-2的mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量均有所降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

      表6 各組大鼠PAR-2的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

      圖1 各組大鼠PAR-2蛋白Western blot電泳圖

      3 討論

      IBS是一種與多因素相關(guān)的疾病,具有復(fù)雜的潛在發(fā)病機(jī)制,至今尚未有完整、確切的解釋。目前,內(nèi)臟高敏感是對(duì)該病的發(fā)病機(jī)制闡述中較普遍的認(rèn)識(shí)之一。中醫(yī)學(xué)將IBS-D歸為“泄瀉”“腹痛”的范疇,肝失疏泄、脾胃虛弱是主要病機(jī)[10]。足三里屬胃經(jīng)合穴、胃下合穴,可補(bǔ)中益氣,通過(guò)相關(guān)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,臨床上針刺治療IBS-D時(shí),足三里穴是使用頻率較高的穴位之一[11]。研究表明,電針足三里穴可明顯糾正偏于正常生理狀態(tài)的胃腸功能抑制狀態(tài),對(duì)胃腸功能起促進(jìn)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,電針組大鼠的腹瀉指數(shù)、Bristol評(píng)分明顯降低;CRD容量閾值明顯升高;AWR評(píng)分明顯降低,表明電針足三里能降低IBS-D模型大鼠的內(nèi)臟敏感,并改善其腹瀉情況。

      隨著IBS生理病理研究的不斷深入,近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)PAR-2介導(dǎo)的信號(hào)通路在其發(fā)病機(jī)制中起到重要影響。PAR-2存在于體內(nèi)多種組織或器官中,其在胃腸道內(nèi)分布較為廣泛,同時(shí)胃腸道內(nèi)含有多種能激活PAR-2的蛋白酶,被激活后的PAR-2會(huì)產(chǎn)生多種能影響消化系統(tǒng)功能的生物學(xué)效應(yīng),且被認(rèn)為與多種消化系統(tǒng)疾病有密切的聯(lián)系。已有的研究[13-17]發(fā)現(xiàn):PAR-2在控制人結(jié)腸黏膜通透性中起著重要作用,PAR-2活性的增加是IBS直腸黏膜通透性增加的原因之一;IBS-D患者的糞便中的蛋白酶活性較高,推斷PAR-2與IBS-D的發(fā)病存在一定的聯(lián)系,并且還發(fā)現(xiàn)當(dāng)外源性的PAR-2激動(dòng)劑在大鼠體內(nèi)發(fā)生作用時(shí),內(nèi)臟敏感的閾值會(huì)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì);IBS患者腸組織中PAR-2的表達(dá)量較健康人升高;PAR-2受體信號(hào)傳導(dǎo)可能是IBS-D患者中傷害感受器持續(xù)過(guò)度興奮的基礎(chǔ),IBS小鼠模型中PAR-2的激活能增加腸道通透性,并且導(dǎo)致免疫激活和內(nèi)臟超敏反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠PAR-2的mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯增多,而電針可以降低其表達(dá)。由此推測(cè),IBS-D的發(fā)病機(jī)制可能與PAR-2存在密切聯(lián)系,電針足三里穴改善IBS-D模型大鼠的腹瀉及內(nèi)臟高敏感可能與PAR-2的表達(dá)水平降低有關(guān)。而PAR-2及其相關(guān)的信號(hào)通路如何在電針過(guò)程中發(fā)揮作用,還有待于今后的進(jìn)一步研究。

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