徐園 賈黎華 虞偉明

胃癌是常見的實體惡性腫瘤之一，已成為全球第五大最常見惡性腫瘤和第三大惡性腫瘤相關(guān)死亡原因[1-3]。盡管近年來臨床在胃癌診斷和治療方面取得了較大進(jìn)展，但其仍然是一種死亡率極高和預(yù)后不良的疾病[4]。根治性手術(shù)切除是胃癌的重要治療方法。然而，由于胃癌缺乏早期特異性癥狀，多數(shù)患者被診斷時已是晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時機(jī)。另外，在接受根治性手術(shù)切除的胃癌患者中，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移也常發(fā)生。為了改善胃癌患者的預(yù)后，在過去的幾十年里，世界范圍內(nèi)已經(jīng)嘗試了多種治療方法，包括化療、放療、靶向治療等，但效果并不理想[5-6]。探尋胃癌新的生物標(biāo)志物或治療靶點意義重大。神經(jīng)元再生相關(guān)蛋白（neuronal regeneration associated protein, NREP），又稱C5orf13或P311，是一種高度保守的8 kDa胞內(nèi)蛋白，含有68個氨基酸[7-8]。研究表明，NREP在胚胎、小鼠大腦中高表達(dá)，可參與細(xì)胞增殖、遷移和分化等多種生物學(xué)功能[9-10]。且NREP在惡性腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[11]、前列腺癌[12]、食管癌[13]等。然而NREP在胃癌中的研究報道不多?；诖?，本研究旨在探討NREP在胃癌中的表達(dá)情況，并分析其臨床意義。通過挖掘不同公共在線生物信息數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，探討NREP在胃癌組織中的表達(dá)情況，并應(yīng)用基因芯片和免疫組化方法驗證其表達(dá)情況，分析NREP表達(dá)的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 研究標(biāo)本 選取2021年3月至8月在寧波市李惠利醫(yī)院接受D2根治術(shù)的胃癌患者20例，術(shù)前均未接受放化療。其中男12例，女8例；年齡18～85歲，平均年齡56歲。留取患者胃癌組織和對應(yīng)的癌旁正常組織作為研究標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：KY2021PJ122），患者家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 在線生物信息數(shù)據(jù)分析胃癌組織NREP mRNA的表達(dá) 使用3個不同在線生物信息數(shù)據(jù)庫分析NREP mRNA在胃癌中的表達(dá)情況。（1）使用Oncomine數(shù)據(jù)庫（http://www.oncomine.org），其為公共在線癌癥微陣列數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)挖掘平臺。本研究閾值如下：P=0.01；差異倍數(shù)=2.0；數(shù)據(jù)類型：mRNA；范圍：前10%的基因。（2）使用基因表達(dá)譜交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）數(shù)據(jù)庫，其為中國學(xué)者設(shè)計的一個Web服務(wù)器，基于癌癥基因組圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas Program,TCGA）和基因型組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Genotype-Tissue Expression,GTEx）中的9 736個腫瘤樣本和8 587個正常樣本。（3）使用Ualcan數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu.），其為一個綜合的計算工具，使用3級RNA測序和從TCGA數(shù)據(jù)庫中的31種癌癥類型中提取的臨床病理參數(shù)，用于分析癌癥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)?；赨CSC Xena數(shù)據(jù)庫分析胃癌患者預(yù)后不良的危險因素。Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析胃癌患者NREP mRNA表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

1.3 基因芯片分析胃癌組織差異表達(dá)基因 使用Trizol試劑提取20例患者的胃癌組織與癌旁正常組織的總RNA，操作參照試劑說明書進(jìn)行。使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0基因芯片（美國昂飛公司）確定基因表達(dá)譜。雜交后，對芯片進(jìn)行清洗和染色。然后，使用Gene Chip Scanner 3000基因芯片掃描儀對微陣列進(jìn)行掃描。采用MAS 5.0算法和Gene Spring 11.0軟件（美國安捷倫技術(shù)公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取和分析。差異表達(dá)基因經(jīng)微陣列顯著性分析篩選。上調(diào)和下調(diào)基因的閾值設(shè)置采用≥2或≤0.5倍的變化。

1.4 人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Altas,HPA）分析胃癌組織NREP蛋白的表達(dá) HPA（https://www.Proteinatlas.org/）是一個免費的公共生物信息數(shù)據(jù)庫，包括蛋白質(zhì)的差異表達(dá)分析和對大約20種惡性腫瘤的免疫染色，可用于分析靶基因的蛋白表達(dá)。本研究通過HPA數(shù)據(jù)庫分析胃癌組織NREP蛋白的表達(dá)水平，并分析NREP在胃癌組織和正常組織中的免疫組化結(jié)果。

1.5 免疫組化檢測胃癌組織和癌旁正常組織NREP蛋白的表達(dá) 從石蠟包埋的胃癌組織、癌旁正常組織標(biāo)本中分別切取5 μm薄切片，脫蠟并提取抗原。組織切片用兔多克隆NREP抗體（英國Abcam公司，1∶200稀釋）在4℃過夜，然后用生物素化的二抗孵育，并用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色（丹麥Dako公司）。染色以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈棕黃色為陽性，由2名病理科醫(yī)生根據(jù)染色深度及染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評定，采用雙盲及統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。不染色為0分，染色淡為1分，染色中度為2分，染色深為3分。染色細(xì)胞百分比≤5%為0分，6%～30%為1分，31%～60%為2分，≥60%為3分。將每張切片的染色深度與染色細(xì)胞百分比得分相乘，其乘積為最后得分。0～1分為（-），2～3分為（+），4～6分為（++），＞6分為（+++）。將（-）及（+）設(shè)定為NREP蛋白低表達(dá)，（++）及（+++）設(shè)定為NREP蛋白高表達(dá)。

1.6 胃癌患者預(yù)后不良的危險因素分析 從UCSC Xena數(shù)據(jù)庫[14]下載患者生物信息，其為一個癌癥基因組數(shù)據(jù)庫，可為公共數(shù)據(jù)提供可視化分析。臨床參數(shù)包括患者性別、年齡、T期、N期、M期、病理分期和組織學(xué)分級，采用單因素和多因素分析胃癌患者預(yù)后不良的危險因素，以評估NREP蛋白表達(dá)對胃癌患者預(yù)后的預(yù)測價值。

1.7 Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析胃癌患者NREP mRNA表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 Kaplan Meier-plotter是一種基于GEO、TCGA和Cancer Biomedical Informatics Grid（caBIG）的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，用于評估各種基因?qū)ι嫘畔⒌挠绊憽１狙芯客ㄟ^Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析胃癌患者NREP mRNA表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

1.8 NREP功能的富集分析 采用基因本體（Gene Ontology,GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析方法研究NREP可能影響胃癌的生物學(xué)功能和信號通路，通過Pearson相關(guān)分析尋找與NREP表達(dá)相關(guān)的基因（|r|≥0.4，P＜0.05）。采用R軟件包對共表達(dá)基因進(jìn)行功能分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件。非正態(tài)分布的計量資料組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。危險因素分析采用Cox比例風(fēng)險模型。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組生存曲線的比較采用logrank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織NREP mRNA表達(dá)水平比較 來自O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫的（Chen數(shù)據(jù)集）分析均顯示，胃癌組織NREP mRNA表達(dá)水平高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1a。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示，胃癌組織NREP mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1b。Ualcan數(shù)據(jù)庫分析顯示，胃癌組織NREP mRNA表達(dá)水平高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1c。

圖1 胃癌組織與癌旁正常組織NREP mRNA表達(dá)水平比較（a：Oncomine數(shù)據(jù)庫；b：GEPIA數(shù)據(jù)庫；c：Ualcan數(shù)據(jù)庫）

2.2 基因芯片檢測胃癌組織NREP mRNA表達(dá)結(jié)果基因芯片微陣列表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)NREP mRNA在胃癌組織中高表達(dá)，胃癌組織中NREP mRNA的表達(dá)水平比癌旁正常組織高至少2.8倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 基因芯片檢測胃癌組織部分呈現(xiàn)異常高表達(dá)的基因

2.3 胃癌組織和癌旁正常組織NREP蛋白表達(dá)情況比較 通過HPA數(shù)據(jù)庫分析NREP在胃癌中的蛋白表達(dá)水平，顯示NREP在胃癌組織中高表達(dá)，呈中、高胞質(zhì)胞膜染色（圖2a，見插頁）。20例胃癌患者的免疫組化檢測結(jié)果顯示，NREP在胃癌組織中細(xì)胞質(zhì)或胞膜呈棕色強(qiáng)染色（圖2b，見插頁），即高表達(dá)，正常組織中呈低染色或不染色（圖2c，見插頁），即低表達(dá)；胃癌組織NREP蛋白高表達(dá)13例（65%），低表達(dá)7例（35%）；癌旁正常組織中NREP高表達(dá)4例（20%），低表達(dá)16例（80%），胃癌組織NREP蛋白高表達(dá)比例高于癌旁正常組織（P＜0.05）。

圖2 胃癌組織和癌旁正常組織NREP蛋白表達(dá)情況比較（a：基于HPA數(shù)據(jù)庫的NREP在胃癌組織中的表達(dá)情況，免疫組化染色，×100；b：NREP在胃癌組織細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中呈陽性染色，DAB染色，×200；c：NREP在癌旁正常組織中呈陰性染色，DAB染色，×400）

2.4 胃癌患者預(yù)后不良的危險因素分析 單因素分析顯示，年齡＞65歲、病理分期Ⅲ/Ⅳ期、T分期高、N分期高、M分期高及NREP高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的危險因素（均P＜0.05）。多因素分析顯示，年齡＞65歲、M分期高、NREP高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素（均P＜0.05），見表2。

表2 胃癌患者預(yù)后不良的危險因素分析

2.5 胃癌患者NREP mRNA表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系分析Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析顯示，NREP mRNA低表達(dá)胃癌患者總生存時間、無進(jìn)展生存時間均優(yōu)于高表達(dá)胃癌患者（均P＜0.05），見圖3（插頁）。

圖3 胃癌患者NREP mRNA高表達(dá)與低表達(dá)患者生存曲線比較（a：總生存曲線比較；b：無進(jìn)展生存曲線比較）

2.6 NREP基因功能富集分析結(jié)果 GO富集分析顯示，NREP基因編碼蛋白質(zhì)主要定位于含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細(xì)胞外基質(zhì)成分膠原三聚體、基底膜。這些蛋白主要參與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組建、細(xì)胞外基質(zhì)組建、成骨、細(xì)胞底物黏附和結(jié)締組織發(fā)育。KEGG通路分析顯示NREP主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)受體的相互作用、黏著斑、PI3K-Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染和細(xì)胞骨架作用調(diào)控等方面，見圖4。

圖4 NREP基因功能富集分析結(jié)果（a：在生物過程、細(xì)胞成分和分子功能等方面的GO富集分析；b：KEGG通路分析）

3 討論

由于缺乏早期診斷方法和腫瘤的強(qiáng)侵襲性，胃癌已成為全世界最致命的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率仍居高不下。尋求新型的功能性生物標(biāo)志物來幫助早期診斷和預(yù)測預(yù)后顯得尤為重要。在生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫的幫助下，本研究探索了新的早期診斷生物標(biāo)志物，并試圖研究其參與胃癌發(fā)生和發(fā)展的潛在分子機(jī)制。

NREP最初研究報道其主要存在于神經(jīng)元和肌肉中[15]。現(xiàn)有關(guān)NREP的研究在逐漸增多，已有多項研究表明，NREP可參與促進(jìn)神經(jīng)和肺組織再生[16-17]、腎纖維化[18]、皮膚創(chuàng)傷血管生成[19]、肌成纖維細(xì)胞分化和遷移。此外，NREP在腫瘤中的作用和發(fā)揮的功能也引起了諸多學(xué)者的關(guān)注。

Mariani等[11]研究發(fā)現(xiàn)NREP在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中高表達(dá)，具有促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)展的作用。McDonough等[20]則進(jìn)一步研究了NREP促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制，認(rèn)為NREP高表達(dá)可能通過激活Rac1，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，進(jìn)而影響細(xì)胞外周肌動蛋白，引起細(xì)胞骨架重構(gòu)，在調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的運動和侵襲方面發(fā)揮了重要作用。唐春蘭等[21]發(fā)現(xiàn)NREP在肺小細(xì)胞癌中呈現(xiàn)過表達(dá)，且NREP與ITGB4BP存在相互作用，NREP可能通過NREP-ITGB4BP信號通路調(diào)節(jié)小細(xì)胞肺癌的遷移，從而參與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

在本研究中，GEPIA、Oncomine和Ualcan等在線數(shù)據(jù)庫均顯示NREP mRNA在胃癌中呈高表達(dá)。此外，我們利用基因芯片、免疫組化等方法也驗證了NREP在胃癌中的表達(dá)水平。KM-Plotter和GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示NREP高表達(dá)與胃癌的總生存時間和無進(jìn)展生存時間不良密切相關(guān)?；赥CGA的原始數(shù)據(jù)，多因素Cox回歸分析顯示NREP是胃癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子之一。據(jù)此，筆者推測NREP或可作為評價胃癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。

在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，包括胃癌在內(nèi)，腫瘤細(xì)胞必須與外基質(zhì)緊密結(jié)合，并與其他細(xì)胞溝通，形成適合增殖并最終轉(zhuǎn)移的間質(zhì)微環(huán)境[22-23]。GO富集分析表明，NREP編碼的蛋白質(zhì)主要定位于含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、基底膜等處。這些蛋白在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織形成、細(xì)胞外基質(zhì)組建、細(xì)胞底物黏附和結(jié)締組織的發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，它們還參與膠原結(jié)合、整合素結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合和形成具有抗拉強(qiáng)度的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分，在腫瘤細(xì)胞增殖過程中提供了良好的間質(zhì)微環(huán)境，并為腫瘤細(xì)胞最終發(fā)生侵襲，轉(zhuǎn)移提供條件。

KEGG通路分析顯示NREP主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、局灶黏附、PI3K-Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染和細(xì)胞骨架作用調(diào)控等。近年來研究發(fā)現(xiàn)局灶黏附與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要途徑[24]。局灶黏附是一種細(xì)胞底物黏附結(jié)構(gòu)，在整合素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮功能作用[25]。局灶性黏附與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用與整合素有關(guān)，這是一種異質(zhì)二聚體細(xì)胞表面受體，參與細(xì)胞與細(xì)胞之間的特異性相互作用和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附。由此筆者推測，NREP可能為胃癌形成并最終轉(zhuǎn)移提供了良好的間質(zhì)微環(huán)境，并可能通過調(diào)控腫瘤黏附與ECM受體的相互作用，參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，NREP在胃癌組織中高表達(dá)，且其高表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。NREP或參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，可作為胃癌診斷和治療的新靶點。