核果類果樹種子休眠的機(jī)制及其解除方法研究進(jìn)展

韋丹丹，劉鑫，包維楷

(1中國科學(xué)院山地生態(tài)恢復(fù)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生態(tài)恢復(fù)與多樣性保育四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041; 2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

核果類果樹植物多為落葉喬木或灌木，種類眾多，野生種類約200種，栽培品種達(dá)10 000種以上，主要分布于溫帶氣候區(qū)[1]。近200年來，由于分類系統(tǒng)的不同，各國學(xué)者對核果植物一直持有2種不同的分類觀點(diǎn)，即廣義李屬與狹義李屬。持有廣義李屬分類觀點(diǎn)的植物學(xué)家認(rèn)為桃、李、杏、梅、櫻、稠李的花結(jié)構(gòu)差異不大，應(yīng)為同屬。而支持狹義李屬的植物學(xué)家根據(jù)物種間芽排列、花序、果實(shí)等方面的差異，按照植物演化發(fā)展階段的高低將核果類果樹分為6屬，依次為桃屬(Amygdalus)、杏屬(Armeniaca)、李屬(Prunus)、櫻屬(Cerasus)、稠李屬(Padus)、桂櫻屬(Laurocerasus)，隸屬于薔薇科李亞科(Prunoideae)[2]。 目前廣義李屬分類受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛認(rèn)可，但其分類范圍、屬下類群分類處理差異、部分種的分類仍存在爭議[3]。隨著分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展，學(xué)者們基于花器官形態(tài)特征將廣義李屬分為落葉單花類群、落葉傘形花序類群以及總狀花序類群，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示這些類群為單系群，但類群內(nèi)部的屬及亞屬的單系性尚未解決[4-5]。如部分學(xué)者認(rèn)為在總狀花序類群中，稠李亞屬和桂櫻亞屬均不構(gòu)成單系，而近期國內(nèi)學(xué)者分別利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建了薔薇科的系統(tǒng)發(fā)育框架，認(rèn)為除扁核木屬外，其他李屬成員均形成單系[6-7]。葉脈序列、分子系統(tǒng)學(xué)及花器官形態(tài)研究結(jié)果均支持將矮櫻類從櫻亞屬中分出，以矮櫻組的形式歸于李亞屬下[3，8-9]。

核果類果樹兼具良好的觀賞價值、經(jīng)濟(jì)價值與生態(tài)價值，其花色優(yōu)美、果實(shí)香甜可口、種子富含油脂、營養(yǎng)價值高，是享譽(yù)世界的園林綠化樹種、經(jīng)濟(jì)樹種及木本油料作物；其根系發(fā)達(dá)、生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，是涵養(yǎng)水源、防風(fēng)固沙的優(yōu)良樹種[10-12]。然而，核果類種子休眠程度較深，導(dǎo)致萌發(fā)育種難度增大，因此深入揭示核果類果樹的種子休眠機(jī)制及萌發(fā)特性，是核果植物資源充分保護(hù)與利用的關(guān)鍵[13]。目前有關(guān)核果種子休眠機(jī)制尚未有全面系統(tǒng)的認(rèn)識，不同種子休眠程度、休眠解除方式存在較大的差異性，即使是同一種種子，不同研究者對其休眠機(jī)制及打破方法均有不同的看法，系統(tǒng)揭示核果休眠機(jī)制與解除方法對種子繁育技術(shù)的優(yōu)化具有重要的實(shí)踐意義。因此，本研究聚焦核果類果樹種子休眠規(guī)律及其解除方法，系統(tǒng)地歸納闡述已有認(rèn)識，以期為核果類果樹繁育技術(shù)的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 核果類果樹種子的休眠機(jī)制

核果果樹種子的休眠機(jī)制可歸于2大類：內(nèi)源因素與外源因素。內(nèi)源因素是指因種胚引起的休眠，主要受萌發(fā)抑制物的調(diào)控；外源因素由種胚以外的結(jié)構(gòu)引起的休眠，即果皮、種皮、子葉的機(jī)械阻礙與萌發(fā)抑制物等。

1.1 果肉(Pulp)對種子萌發(fā)的影響

多種研究表明，核果類植物果肉中含有高濃度的萌發(fā)抑制物，如Chen 等人在成熟的鐘花櫻桃(Cerasuscampanulata)果肉中檢測出脫落酸(ABA)的存在，其含量為35.76 ng/粒，約占果實(shí)總ABA含量的76%[14]。Chen等人在禿葉黃檗(Phellodendronchinensevar.glabriusculum)新鮮果肉中檢測出ABA濃度高達(dá)3 160 ng/g DW，ng/g DW(表示每克干物質(zhì)組織中ABA的含量)約是新鮮種子內(nèi)部ABA濃度的24倍，其內(nèi)部赤霉素(GAs)種類較少且含量較低，其中GA4僅為2.45 ng/g DW，GA20為2.28 ng/g DW[15]。但上述研究均未涉及果肉保留對種子萌發(fā)影響的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，因此無法解釋果肉中高濃度的ABA是否抑制了種子萌發(fā)。安瑞麗和方海濤先后發(fā)現(xiàn)，長柄扁桃(Amygdaluspedunculata)果肉浸提液具有抑制小麥種子萌發(fā)及葉綠素合成的作用，間接表明果肉中的萌發(fā)抑制物具有抑制種子萌發(fā)的作用[16]。

目前在種子生態(tài)學(xué)研究中，人們對核果果肉與種子休眠間聯(lián)系的關(guān)注度較低，果肉與種子休眠間還有許多問題尚未弄清。例如在果肉消失的過程中，其內(nèi)部高濃度的ABA是否影響種子的休眠，微生物的作用、內(nèi)源激素的變化是否與種子的休眠存在聯(lián)系也尚未可知，因此果肉對種子休眠與萌發(fā)的作用機(jī)制值得深入探討。

1.2 內(nèi)果皮(Endocarp)對種子萌發(fā)的制約

核果類果樹種子進(jìn)化出堅(jiān)硬致密的內(nèi)果皮(種殼)，對種子起到良好的保護(hù)作用，但也阻礙了種子的萌發(fā)。Chen 等發(fā)現(xiàn)鐘花櫻桃完整種子無法發(fā)芽，去殼后種子發(fā)芽率可提高25%[14]。張?zhí)吹妊芯恳脖砻?，隨著內(nèi)果皮機(jī)械破碎程度的增大，蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)種子發(fā)芽率由15%提高至90%，說明種殼是阻礙萌發(fā)的重要因素[17]。Afroze and Reilly發(fā)現(xiàn)在相同處理下，黑刺李(Prunusspinosa)種子的內(nèi)果皮越厚，發(fā)芽率越低(39%～52%)；Chen 等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)鐘花櫻桃種殼平均厚度1.03 mm，種子萌發(fā)效果較差(發(fā)芽率<31%)[14]。表明內(nèi)果皮對種子萌發(fā)的阻礙存在差異，其中內(nèi)果皮厚度是核果種子物理休眠的關(guān)鍵。

內(nèi)果皮對種子萌發(fā)的物理阻礙主要?dú)w因于其對吸水率、透氣性的限制。在長柄扁桃、野生歐洲李(Prunusdomestica)中均發(fā)現(xiàn)去殼種子吸水速率高于帶殼種子的現(xiàn)象，說明核果種子內(nèi)果皮具有透水性，但阻礙種子吸水速率[17-19]。陶俊、Jaganathan等分別在桃(Amygdaluspersica)、杏(Prunusarmeniaca)種子萌發(fā)研究中發(fā)現(xiàn)，只要給予足夠的浸泡時間軟化種皮，滿足吸脹的先決條件，種子便能萌發(fā)，說明內(nèi)果皮透水性不是影響核果種子萌發(fā)的主要原因[20-21]。王志梅發(fā)現(xiàn)，歐李(Cerasushumilis)種子形成初期，去殼種子呼吸強(qiáng)度明顯大于帶殼種子，表明內(nèi)果皮對種子透氣性造成一定的阻礙，但尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)果皮透氣性是阻礙種子萌發(fā)主要原因的直接證據(jù)[22]。

除了對透性造成物理阻礙外，核果種子內(nèi)果皮中檢測出高濃度的萌發(fā)抑制物，如方海濤利用小麥種子測定蒙古扁桃種子不同部位粗提取物的生物活性，發(fā)現(xiàn)種皮浸提液對小麥根、芽的生長均產(chǎn)生抑制作用，且溶于乙醚的抑制物活性大于水溶性抑制物，間接表明種子中可能含有多種內(nèi)源抑制物[23]。在野生櫻桃李(Prunuscerasifera)、新疆野杏(Armeniacavulgaris)中均發(fā)現(xiàn)ABA是內(nèi)果皮中重要的萌發(fā)抑制物，去除內(nèi)果皮可有效促進(jìn)種子萌發(fā)[24-25]。Chen等測定鐘花櫻桃種子中各部位ABA含量，發(fā)現(xiàn)內(nèi)果皮ABA含量高達(dá)6.66 ng/粒，是種皮的2.3倍，種胚的4.2倍，與完整種子(0%)相比，去殼種子發(fā)芽率提高25%[14]。核桃為擬核果，其種殼提取液中含有較高濃度的水溶性多酚、黃酮類物質(zhì)，對植物種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用[26]。以上研究均表明，內(nèi)果皮中高濃度的萌發(fā)抑制物也是阻礙萌發(fā)的主要原因，且不同種子內(nèi)果皮萌發(fā)抑制物含量大小存在差異。

綜上所述，內(nèi)果皮是核果類果樹種子休眠的重要因素，它通過阻礙透水透氣、內(nèi)源萌發(fā)抑制物的作用促進(jìn)種子休眠，但萌發(fā)抑制物的影響條件、作用機(jī)制有待深入探討。

1.3 種皮(Seed coat)對種子萌發(fā)的制約

已有研究表明，除了果肉、內(nèi)果皮外，種皮也對種子萌發(fā)產(chǎn)生制約作用，如李會芳在探究櫻桃李種子萌發(fā)的影響因素時發(fā)現(xiàn)，櫻桃李完整種子(0%)與去殼種子(2%)間的發(fā)芽率無明顯差異，但去皮種子發(fā)芽率提高至78%[24]。Jansen and Kristiansen發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)低溫處理的酸櫻桃種子，去掉種皮后在20 ℃培養(yǎng)條件下發(fā)芽率達(dá)50%以上[27]。此外，在李(Prunusdomestica)、鐘花櫻桃、桃、高盆櫻桃(Prunuscerasoides)、東京櫻桃(Cerasus×yedoensis)等多種核果種子中也發(fā)現(xiàn)去除種皮可以有效促進(jìn)種子萌發(fā)[13-14，28-31]。

大量研究證明，種皮機(jī)械阻力有限，內(nèi)源萌發(fā)抑制物是阻礙核果種子萌發(fā)的主要原因[14,23,25,29]。早期，研究人員在LoveⅡ桃種子中發(fā)現(xiàn)，種皮中高濃度的ABA是阻礙種子萌發(fā)的主要因素[32]。隨后鄭然在山桃(Amygdalusdavidiana)新鮮種子中發(fā)現(xiàn)，種皮中ABA含量為690.07 ng/g FW(每克鮮物質(zhì)組織中ABA的含量)，去除胚根處種皮后發(fā)芽率為26%，完全去皮后提高至40%[33]。Chen等在鐘花櫻桃種皮中檢測出ABA含量為2.850 ng/粒，并發(fā)現(xiàn)去皮后種胚發(fā)芽率提高，發(fā)芽周期縮短[14]。說明不同核果種子中種皮抑制物含量存在差異，去除種皮可同時解除種皮的物理阻礙與生物阻礙，利于種子萌發(fā)。但在生產(chǎn)實(shí)踐上，大批量去除種皮難度較大，且種皮去除后，種子極易受細(xì)菌侵染霉壞變質(zhì)造成損失，機(jī)械去除種皮實(shí)用性有限[18,23,34]。綜上所述，種皮對種子萌發(fā)的阻礙主要受其內(nèi)部高濃度的萌發(fā)抑制物調(diào)控，但萌發(fā)抑制物的作用含量、作用機(jī)制有待進(jìn)一步的探究。

1.4 種胚(Embryo)對種子萌發(fā)的制約

除了部分早熟栽培品種具有形態(tài)休眠外，多數(shù)核果類果樹種子具有生理休眠的特征，即種胚形態(tài)成熟、發(fā)育完全，但需要經(jīng)歷一段時間的低溫刺激才能萌發(fā)[35-36]。鄭然等曾報(bào)道，山桃種胚中ABA含量為303.32 ng/g FW，去皮后種胚萌發(fā)率僅為40%，說明胚中的ABA對萌發(fā)造成了阻礙, 種胚中的萌發(fā)抑制物，是導(dǎo)致種子生理休眠的重要原因[36]。

子葉與胚軸中的ABA是阻礙胚根伸長的主要原因，從子葉中分離胚可以解除種子胚休眠，如山桃種胚發(fā)芽率為40%，去除子葉后胚可完全萌發(fā)[33]。在歐洲酸櫻桃(Prunuscerasus)、桃、杏種子中也發(fā)現(xiàn)，切除掉部分子葉可有效降低萌發(fā)抑制物含量，提高發(fā)芽率，縮短萌發(fā)時間，但去除子葉的同時也帶走了一部分的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致幼苗出現(xiàn)發(fā)育不良，植株矮小等現(xiàn)象[27,37]。Bonamy and Dennis曾報(bào)道，栽培桃品種“Halford”胚軸中ABA含量是種皮和子葉的10～100倍，并認(rèn)為胚軸中高濃度的ABA與胚生理休眠存在一定的聯(lián)系[38]。Pawasut等在探討低溫處理下3種觀賞桃品種的ABA含量變化發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)歷低溫處理后，“Kanpaku”桃發(fā)芽效果不理想，其種胚中的ABA含量上升至1.2 ng，達(dá)內(nèi)部ABA含量的51%，胚軸中的ABA可能是阻礙萌發(fā)的主要原因[13]。綜上，子葉與胚軸中高濃度的萌發(fā)抑制物可能是誘導(dǎo)種胚生理休眠的重要原因，但其作用機(jī)制尚未清楚。

1.5 激素對種子休眠與萌發(fā)狀態(tài)的調(diào)控

種子休眠、萌發(fā)過程與植物各種內(nèi)源激素的相互作用息息相關(guān)。目前，已從多種植物果實(shí)、種子中分離出脫落酸、有機(jī)酸、酚類、醛類、不飽和內(nèi)脂類、芳香油、氣體物質(zhì)、芥子油、生物堿等多種抑制物，而內(nèi)源激素被認(rèn)為是誘導(dǎo)種子休眠眾多因子中最重要的因素。核果種子中抑制物的種類尚未研究透徹，其中ABA是已確定的主要內(nèi)源激素之一，存在于果肉、內(nèi)果皮、內(nèi)種皮、胚等各結(jié)構(gòu)中，各部位的ABA可能對抑制萌發(fā)起到了疊加的作用。種子休眠的誘導(dǎo)和解除與內(nèi)部ABA/GAs有關(guān)，主要受環(huán)境條件和內(nèi)源信號的共同調(diào)節(jié)。

ABA是調(diào)控種子休眠與萌發(fā)過程中最關(guān)鍵的植物激素。在高等植物中， 9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧酶(NCED)是ABA合成過程的關(guān)鍵物質(zhì)，在擬南芥中已確定了9種相關(guān)序列，但目前僅發(fā)現(xiàn)AtNCED5、AtNCED6、AtNCED9這3種基因序列影響種子休眠與萌發(fā)[39]。由CYP707A編碼的ABA 8’-羥化酶是調(diào)控ABA代謝的關(guān)鍵蛋白，其中AtCYP707A1主要在種子成熟中期時的種皮和胚乳中表達(dá)，而AtCYP707A2則主要在種子成熟后期的種皮、胚、胚乳中表達(dá)[40]。桃種子休眠主要受PpNCED1和PpNCED2這2個關(guān)鍵基因的誘導(dǎo)，并通過上調(diào)CYP707As基因家族(PpCYP707A2、PpCYP707A3)的表達(dá)終止該過程，從而調(diào)控種子的休眠與萌發(fā)[41]。一般認(rèn)為GAs與ABA在種子休眠與萌發(fā)的過程中起拮抗作用，有研究發(fā)現(xiàn)，GA3浸種、低溫層積等處理均可使桃種子內(nèi)部與ABA合成相關(guān)的基因下調(diào)，ABA合成減少；但尚未發(fā)現(xiàn)GAs處理后種子中ABA被分解代謝的分子機(jī)制的相關(guān)報(bào)道，因此GA3可能通過調(diào)節(jié)ABA合成調(diào)節(jié)種子休眠狀態(tài)[41-42]。

外界環(huán)境變化引起種子休眠程度的改變也與內(nèi)部激素密切相關(guān)。隨著環(huán)境因子的季節(jié)性變化，核果類果樹種子感知環(huán)境刺激，將外部信號轉(zhuǎn)化為內(nèi)部信號，誘導(dǎo)二次休眠或循環(huán)休眠的產(chǎn)生[36]。如Stephen等發(fā)現(xiàn)，歐洲櫻桃種子進(jìn)入二次休眠后，與ABA不敏感的2類相關(guān)基因Pa-PP2C1和Pa-ABI3停止表達(dá)，但這2類基因出現(xiàn)在初級休眠種子的胚軸中[43]。表明外部環(huán)境因子通過影響種子內(nèi)部激素相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控種子的休眠狀態(tài)，且種子初級休眠與二次休眠具有不同的調(diào)控機(jī)制。不同核果種子進(jìn)入二次休眠的誘發(fā)條件不同，如外界溫度的周期性波動是誘導(dǎo)黑刺李、歐洲甜櫻桃(Cerasusavium)種子進(jìn)入二次休眠的主要原因，而光照、濕度、鹽堿脅迫造成的低滲透勢等可改變蒙古扁桃種子的休眠程度[18,44-45]。如圖1所示，為了探究環(huán)境因子、GAs、ABA的變化與種子休眠程度間的關(guān)系，研究人員利用擬南芥(Arabidopsisthaliana)作為研究對象，發(fā)現(xiàn)參與此過程的基因主要與ABA、GAs代謝及信號通路有關(guān)，ABA/GAs平衡類似中心集合點(diǎn)，其下游調(diào)控種子休眠萌發(fā)的基因已被大量識別，但上游響應(yīng)環(huán)境因子變化的相關(guān)基因信號尚不清楚，這是了解三者間作用機(jī)制的關(guān)鍵[46-48]。核果種子二次休眠的產(chǎn)生機(jī)制及誘導(dǎo)因素較為復(fù)雜，相關(guān)研究較少，仍需進(jìn)行深入探究。

注：環(huán)境因子調(diào)控ABA-GAs平衡影響種子休眠狀態(tài)的模型。圖1 環(huán)境因子調(diào)控ABA-GAs平衡影響種子休眠狀態(tài)的模型Figure 1 Model for environmental factors on regulating ABA-GAs balance on seed dormancy state

除ABA與GAs外，細(xì)胞分裂素(CK)、玉米素核苷(ZR)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、乙烯類等多種激素也都可通過影響ABA/GAs的平衡，間接參與休眠與萌發(fā)的調(diào)控過程[49-50]。在大葉樸(Celtiskoraiensis)、金絲李(Garciniapaucinervis)等核果種子萌發(fā)過程中均發(fā)現(xiàn)GAs、CK、IAA含量逐漸增加，ABA含量下降的現(xiàn)象[51-52]。山桃在經(jīng)過16周低溫處理的過程中，種皮與種胚中ABA含量分別從690.07 ng/g FW、330.32 ng/g FW下降至183.70 ng/g FW、91.15 ng/g FW，而胚軸中IAA含量上升近200倍，也說明種子休眠與萌發(fā)的實(shí)質(zhì)，是多種促萌發(fā)激素與促休眠激素間相互作用的結(jié)果[33]。

2 核果類果樹種子休眠的解除

李屬核果種子綜合休眠的特征主要受種皮機(jī)械阻力、物理障礙、各部位萌發(fā)抑制物等多種因素的共同作用，解除種子休眠，需要從以下幾個方面入手。對于休眠程度淺的種子，去除種皮或低溫層積后便可萌發(fā)，而休眠程度較深的種子，則需要同時突破種皮與胚的雙重阻礙才可獲得較好的發(fā)芽效果(表1)。

表1 不同核果種子解除休眠的最佳處理方案Table 1 Optimal treatments to release seed dormancy in different drupes

2.1 種皮休眠的解除方法及其效果

核果種子種皮由內(nèi)果皮(種殼)與內(nèi)種皮構(gòu)成，常用機(jī)械破核、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿浸種、熱水浸種、液氮浸種等處理方式解除種子機(jī)械休眠，但不同物種間處理效果具有較大差異。

核果類植物種子內(nèi)果皮與種皮具有致密的包裹結(jié)構(gòu)，阻礙種胚的向外擴(kuò)展，抑制種子萌發(fā)，因此機(jī)械破核是快速解除此類種子物理休眠的有效方式。完整的東京櫻花種子在變溫層積的預(yù)處理下并未萌發(fā)，但機(jī)械去除內(nèi)果皮與種皮后，種子萌發(fā)率高達(dá)90%，而完整的高盆櫻桃種子在機(jī)械去除種皮后，萌發(fā)率可達(dá)70%～100%[30-31]。除櫻桃外，機(jī)械去殼在促進(jìn)長柄扁桃、野生杏(Prunusscoparia,P.communis，P.haussknechtii)種子萌發(fā)中均獲得較好的效果[53-54]。但機(jī)械破核成本較高，且易對種子造成損壞，不適用于核果類植物種子大規(guī)模苗木繁育。

濃硫酸浸種是生產(chǎn)上解除種子物理休眠的常用方式，強(qiáng)酸腐蝕在部分解除種皮機(jī)械阻礙的同時起到殺菌作用，利于種子的無菌萌發(fā)。濃硫酸處理效果與種子類型、處理濃度、處理時間等因素有關(guān)。Pipinis等人的研究表明，濃硫酸(95%～97%)浸種可有效解除Prunusazorica種殼的機(jī)械阻礙，但隨著處理時間的增加(45～180 min)，種子發(fā)芽率不斷下降(27%～8%)[34]。張?zhí)吹仍谔骄坎煌幚韺﹂L柄扁桃萌發(fā)的影響時也發(fā)現(xiàn)，濃硫酸浸種4 h時發(fā)芽率最高(30%)，而浸種5 h無種子萌發(fā)[17]。說明濃硫酸處理在不同種子間具有較大差異性，且催芽效果與處理時間有關(guān)。但濃硫酸浸種對鐘花櫻桃、野黑櫻桃(Prunusserotina)、馬哈利櫻桃(Cerasusmahaleb)、高盆櫻桃、東京櫻花等多種核果種子萌發(fā)無明顯促進(jìn)作用(發(fā)芽率<5%)，說明種皮的機(jī)械屏障可能不是引起此類種子休眠的主要因素[14，30-31，55-56]。因此應(yīng)根據(jù)種子物理特性，合理選擇浸種藥劑，控制浸種時間，以獲得更好的催芽效果。

熱水浸種主要通過熱脹冷縮的原理，增大縫合線的孔隙，從而增加種皮透性，促進(jìn)種子萌發(fā)[13]。熱水浸種在多種豆科種子休眠解除的研究中已被證實(shí)有效，對杏、長柄扁桃等核果種子休眠解除也有一定的促進(jìn)作用，如長柄扁桃采用連續(xù)重復(fù)3次80 ℃熱水浸泡再速凍處理，冷窖儲存待播的方式，種子出苗率最高(49%)[21，58]。但熱水浸種對馬哈利櫻桃、高盆櫻桃、東京櫻花等多中核果種子發(fā)芽率無明顯促進(jìn)作用[30-31,56]。如馬哈利櫻桃種子90 ℃熱水處理30 min后冷水浸泡，種子發(fā)芽率僅為5%[56]。不同催芽效果的出現(xiàn)可能與種皮厚度、致密性大小等物理性質(zhì)有關(guān)。

液氮浸種利用劇烈溫差使種殼表面形成裂痕，從而減少機(jī)械阻力，促進(jìn)種子萌發(fā)[58-59]。液氮浸種對種子萌發(fā)的促進(jìn)作用與種子含水量有關(guān)，如液氮浸種對高含水率(24%)的東京櫻花種子無明顯的萌發(fā)促進(jìn)作用，而使低含水率(10%)的種子萌發(fā)率提高至63%[31]。在歐洲甜櫻桃中也發(fā)現(xiàn)，在9%～16.9%的含水率區(qū)間內(nèi)，液氮超低溫保存能有效保持種子活力，而含水率高于17%無種子萌發(fā)[58]。Wawrzyniak在對6種歐洲野生木本植物種子中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，并認(rèn)為種子耐干燥及低溫能力與其生理休眠程度有關(guān)[60]。

2.2 低溫層積法解除休眠及其效果

低溫層積是解除種子生理休眠最傳統(tǒng)的處理方式，層積過程降低ABA/GAs值，從而誘導(dǎo)種子萌發(fā)。低溫層積后山桃種子中游離ABA含量從每粒種子20.4 ng下降至2.2 ng，發(fā)芽率提高至36.7%[33]。相較于切除種皮、子葉等處理方式，低溫層積保存了種子的完整性，給予種胚足夠的生長發(fā)育時間，有利于后期幼苗的生長。

種子萌發(fā)效果與層積時間、層積溫度有關(guān)。一般認(rèn)為，0～10 ℃層積1至4個月是核果種子打破休眠的有效層積方式，但不同品種最適層積溫度、時間存在明顯差異[61]。歐洲稠李(Prunuspadus)種子休眠狀態(tài)解除的最適層積時間為3至4個月[62]?！癝harbati”桃種子在7～10 ℃條件下層積60 d后，種子發(fā)芽率達(dá)63%～70%[21]。而桃、杏種子分別在4～5 ℃層積90 d后去除種皮，發(fā)芽率可達(dá)到96%和100%[51]。核果種子具有最適層積時間，層積時間過短或過長均不利于種子的萌發(fā)。如P.africana在4 ℃條件下層積1個月后，發(fā)芽率為91.7%，超過4個月后無種子萌發(fā)[63]。

層積基質(zhì)也會對種子萌發(fā)造成一定的影響，層積基質(zhì)有利于加速內(nèi)果皮的降解及萌發(fā)抑制物的浸出，從而促進(jìn)種子萌發(fā)。杜紀(jì)紅比較不同層積基質(zhì)對桃種子萌發(fā)率的影響，發(fā)現(xiàn)珍珠巖效果最好(萌發(fā)率97%)，蛭石次之(90%)，河沙(79%)與泥炭(76%)相近，并認(rèn)為珍珠巖在重量、吸濕透氣性能均有較大的優(yōu)勢，是較為理想的基質(zhì)材料[64]。馬哈利櫻桃種子在泥炭蘚與珍珠巖混合的基質(zhì)條件下具有較好的發(fā)芽效果(65%)[56]。但Afroze and Reilly發(fā)現(xiàn)，在泥炭土、珍珠巖、種子體積比為1∶1∶1的層積基質(zhì)條件下, 黑刺李種子發(fā)芽率僅為12%，而無層積基質(zhì)的種子發(fā)芽率為30%，基質(zhì)的存在反而促進(jìn)黑刺李種子的變質(zhì)，降低發(fā)芽速率[18]。說明層積基質(zhì)的材料、組分配比同樣影響種子的萌發(fā)。

2.3 綜合法解除休眠及其效果

層積有利于打破種子各結(jié)構(gòu)中萌發(fā)促進(jìn)物質(zhì)與抑制物質(zhì)之間平衡，完成種胚生理后熟，促進(jìn)胚根伸長，削弱種殼的機(jī)械阻力[65-66]。但研究表明，單純層積處理對多種核果種子的催芽效果有限，如歐洲甜櫻桃、東京櫻花、黑刺李種子在4～5 ℃低溫條件下層積2至6個月，發(fā)芽率仍低于5%[30-31，67]。因此對于休眠程度較深的種子，多種處理方法的結(jié)合可加快休眠解除進(jìn)程，獲得更好的催芽效果。如Pipinis等將去除內(nèi)果皮的馬哈利櫻桃種子置于1 000/2 000 mg/L的GA3溶液中浸泡24 h后，再進(jìn)行30 d低溫層積，種子發(fā)芽率提高至95%～97%[68]。桃、杏種子分別進(jìn)行60 d、90 d的5 ℃低溫層積后再去除種皮，置于20 ℃條件下培養(yǎng)，發(fā)芽率可達(dá)96%與100%，且后續(xù)幼苗生長狀況最好，表明同時去除種皮與種胚的萌發(fā)障礙，種子具有更好的發(fā)芽效果[37]。在歐洲甜櫻桃、歐洲李、黑刺李、馬哈利櫻桃、黑櫻桃(Cerasusmaximowiczii,Prunusazorica)等多種核果種子中發(fā)現(xiàn)，變溫層積處理比單獨(dú)的低溫或暖溫處理對種子萌發(fā)及后續(xù)幼苗生長的促進(jìn)作用更為明顯，表明變溫層積對核果種子休眠解除效果更好[28，43，66-71]。綜上所述，核果植物種子休眠是復(fù)雜的過程，需要根據(jù)休眠類型、休眠深度對層積方式進(jìn)行綜合研究，以適應(yīng)種間差異。

2.4 內(nèi)源萌發(fā)抑制物的解除方法及其效果

核果類種子休眠的深度休眠與種子內(nèi)部的萌發(fā)抑制物含量有關(guān)，可通過流水沖洗、施加外源激素等方式，打破種子內(nèi)源ABA與GAs間的平衡，解除休眠。

流水沖洗主要通過軟化種皮，稀釋萌發(fā)抑制物濃度，起到解除休眠的作用。吉九平曾報(bào)道，淋洗2周的毛桃、山桃種子中游離ABA含量分別下降至158 ng/g與108 ng/g，與層積10周后種子內(nèi)游離ABA含量水平接近[73]。Pawasut等人也發(fā)現(xiàn)，與低溫處理相比，流水沖洗處理的桃種子ABA損失率更高[13]。表明萌發(fā)抑制物具有水溶性，淋洗能有效降低ABA含量。Javanmard等發(fā)現(xiàn)歐洲甜櫻桃流水沖洗24 h后，種子發(fā)芽率從0提升至26.5%，發(fā)芽時間明顯縮短[74]。以上現(xiàn)象表明，具有可滲透性種皮的種子，若給予合適的沖洗時間，可促進(jìn)種子萌發(fā)。但對于種殼較厚、休眠程度較深的種子，如東京櫻花，流水沖洗對種子萌發(fā)的促進(jìn)作用不顯著[31]。

外源施用赤霉酸可解除生理休眠、熱休眠和光休眠等，并能在一定程度上替代低溫層積對種子萌發(fā)的促進(jìn)作用，但其作用效果與物種休眠類型、內(nèi)部GAs含量有關(guān)。與單獨(dú)施加GA3或低溫層積相比，赤霉素結(jié)合低溫層積處理，可以有效的提高核果類種子的萌發(fā)率。如東京櫻花種子去皮后，置于1 000 mg/L的GA3浸種并充分震蕩，種子發(fā)芽率可高達(dá)97%[31]。野黑櫻桃種子GA3浸種結(jié)合21～24周的低溫處理，可達(dá)到最高發(fā)芽率(62%)[14]。馬哈利櫻桃解除休眠的最佳處理方式為60～90 d的低溫層積結(jié)合1 000 mg/L的GA3溶液浸種[56]。除GA3以外，氟洛酮(Fluridone)、萘乙酸(NAA)、6-BA、乙烯利等對解除萌發(fā)抑制物導(dǎo)致的休眠均可產(chǎn)生一定的作用。NAA、6-BA與ABA產(chǎn)生拮抗作用，外源施加可有效提高黑刺李、光核桃(Amygdalusmira)種子的發(fā)芽率，縮短發(fā)芽時間[18,75]。Fluridone是一種類胡蘿卜素生物合成抑制劑，通過阻礙ABA相關(guān)基因的表達(dá)起到降低ABA含量的作用，如Kanjana等人就曾報(bào)道，F(xiàn)luridone可通過影響NCED1、ABA8′-hydroxylase3、LeMADS、LEAD-34這4種基因的表達(dá)，改變ABA合成量及生理代謝，促進(jìn)桃種子萌發(fā)[77]。

3 展望

種子休眠是植物應(yīng)對外界環(huán)境周期性變化的適應(yīng)性進(jìn)化，有利于種群遺傳物質(zhì)的保存與延續(xù)。核果植物種子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，通常兼具綜合性休眠的特征，主要與各部位的萌發(fā)抑制物、內(nèi)果皮與種皮的機(jī)械阻力、胚生理后熟有關(guān)。不同核果種子性狀特征、休眠類型、休眠程度不同，種子解除休眠的方法各異。目前常用的破眠方法主要包括機(jī)械破核、 酸堿或強(qiáng)氧化劑腐蝕種殼、生長調(diào)節(jié)劑處理等。這些處理在理想的實(shí)驗(yàn)室條件下均獲得較好的催芽效果，但破眠成本較高，無法完全適用于復(fù)雜的野外試驗(yàn)條件。低溫層積是目前核果種子野外催芽較為成熟有效處理方法，但其處理效果受種子類別、種子特性、層積環(huán)境條件、層積時間、層積基質(zhì)等多方面因素的共同影響，無法確保種子獲得穩(wěn)定高效的發(fā)芽效果。綜合處理提高種子發(fā)芽率是近年來研究人員關(guān)注的重點(diǎn)，但此類方法針對性較強(qiáng)，無法應(yīng)用于所有種子。因此，針對不同種子物理化學(xué)特性，開發(fā)便捷高效的催芽技術(shù)，是目前核果類植物種子繁育的關(guān)鍵。

隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，科研人員發(fā)現(xiàn)核果植物種子內(nèi)部ABA與GAs間的平衡是種子休眠與萌發(fā)的關(guān)鍵，此過程的分子調(diào)節(jié)機(jī)制較為復(fù)雜，涉及種子基本性狀特征、環(huán)境因子、生物因子等多種因素，目前仍有許多問題需深入探究。首先，以往研究中果肉對種子休眠萌發(fā)的作用被忽視，在果肉消失的過程中，環(huán)境微生物作用可能通過影響激素含量變化從而調(diào)控種子休眠進(jìn)程，因此果肉在種子休眠與萌發(fā)過程中的作用機(jī)制值得研究。其次，土壤種子庫中的種子具有循環(huán)休眠的特性，其環(huán)境誘導(dǎo)因素及內(nèi)部分子變化機(jī)制研究仍存在大量空白。再次，目前關(guān)于激素平衡對核果種子休眠與萌發(fā)的影響仍主要集中于ABA與GAs上，需擴(kuò)展內(nèi)源激素研究種類，探究種子休眠萌發(fā)過程中各內(nèi)源激素間的相互作用機(jī)理。此外，自然變溫是種子破眠的關(guān)鍵因素，而種子室內(nèi)破眠試驗(yàn)無法完全模擬野外溫度變化狀況，導(dǎo)致研究結(jié)果無法真實(shí)反應(yīng)種子萌發(fā)自然環(huán)境狀況，因此應(yīng)開展種子萌發(fā)原位觀測試驗(yàn)。最后，目前人們對于分布范圍廣、經(jīng)濟(jì)價值高的品種關(guān)注較多，而野生資源品種研究較少，因此亟需擴(kuò)展研究種類，充分認(rèn)識核果類果樹休眠與萌發(fā)特征，以便更好地進(jìn)行資源保護(hù)、開發(fā)與利用。