吳 婷，臧 麗，陳 康，裴 育，巴建明，竇京濤，呂朝暉，母義明，谷偉軍

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 內(nèi)分泌科，北京 100853

Gitelman綜合征(Gitelman syndrome，GS)又名家族性低鉀低鎂血癥，是最常見的遺傳性腎小管病變，呈常染色體隱性遺傳[1]。GS的主要致病機(jī)制為位于染色體16q13上的SLC12A3基因發(fā)生突變，導(dǎo)致噻嗪類敏感的Na-Cl協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium chloridel co-transporter，NCCT)失活，表現(xiàn)為低鉀代謝性堿中毒、低鎂血癥和低尿鈣[2]。有研究表明，該病的患病率為(1 ～ 10)/40 000，在亞洲人群中患病率更高，在日本的患病率達(dá)10.3/10 000[3]。大多數(shù)GS患者起病隱匿，病情輕微，表現(xiàn)為由慢性低鉀、低鎂所導(dǎo)致的乏力、搐搦、夜尿增多等癥狀，但也有合并室性心律失常、橫紋肌溶解、痛風(fēng)、胰島素抵抗等病例的報道[4-7]。由于該病的臨床表現(xiàn)多樣，臨床上存在著漏診、誤診的風(fēng)險。本研究以國內(nèi)最大樣本的GS患者和家系為研究對象，對GS患者基因型與表型的關(guān)系進(jìn)行分析，以期指導(dǎo)診治，改善患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。

資料與方法

1 資料來源 納入2007年7月- 2020年9月于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌科就診的71例臨床診斷為GS的患者，包含其中7例患者的家系。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合2017年Gitelman綜合征診治專家共識(中)的診斷要點(diǎn)[8]；2)留有DNA樣本且臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)無利尿劑、甘草制劑或棉籽油服用史，無腹瀉和嘔吐史；2)排除原發(fā)性或繼發(fā)性腎小球腎炎、腎病綜合征、慢性腎衰竭、慢性腎盂腎炎等。遵循的程序符合《赫爾辛基宣言》原則。所有納入本研究的患者及其家系均簽署知情同意書。

2 表型分析 收集GS患者及其家系的臨床資料，包括年齡、性別、就診時間等基本資料，一般癥狀、神經(jīng)肌肉、泌尿、消化、心血管等系統(tǒng)癥狀、內(nèi)分泌及生長發(fā)育異常等臨床癥狀，血脂、血糖、尿酸、動脈血?dú)?、血尿電解質(zhì)水平等實(shí)驗(yàn)室檢查、腹部超聲、CT等影像學(xué)檢查結(jié)果。

3 基因型分析 提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，測序由上海韋韓斯生物醫(yī)藥科技有限公司完成，首先通過標(biāo)準(zhǔn)的二代測序(next-generation sequencing，NGS)數(shù)據(jù)分析流程與生物信息學(xué)工具，鑒定相應(yīng)基因上的變異，然后在一代測序儀上進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)該患者在已知GS致病基因上的變異情況。將檢測到的突變與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)和PubMed搜索結(jié)果進(jìn)行比對，進(jìn)而過濾、去除與GS無關(guān)的常見變異，最終獲得可能與疾病表型相關(guān)的新發(fā)變異，并用在線軟件SIFT、Polyphen 2和VarSite預(yù)測突變位點(diǎn)的致病性。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，Shapiro-Wilk檢驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。正態(tài)分布計量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析；非正態(tài)分布計量資料以Md(IQR)表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，其組間比較采用χ2檢驗(yàn)或 Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 患者一般資料和臨床癥狀 71例GS患者中，男性44例(62.0%)，女性27例(38.0%)，平均發(fā)病年齡為(26.83±13.80)歲，平均確診年齡為(33.01±13.95)歲。本研究患者生長發(fā)育未見明顯異常，平均體質(zhì)量指數(shù)為(22.72±3.31) kg/m2，血壓正?；蚱停骄獕?116.07±13.13) mmHg/(72.73±8.92) mmHg (收縮壓/舒張壓，1 mmHg=0.133 kPa)。GS患者的臨床表現(xiàn)多樣，最常累及神經(jīng)肌肉系統(tǒng)，肢體乏力為最常見的臨床癥狀(52.1%)，其次為肌無力(40.8%)、多尿(35.2%)、肌肉痙攣或抽搐(26.8%)、肢體麻木(23.9%)、蛋白尿(23.9%)、肌肉疼痛(19.7%)和手抖(19.7%)等，女性相比男性更易出現(xiàn)肌肉痙攣或抽搐(40.7%vs18.2%，P=0.037)和肢體麻木(37.0%vs15.9%，P=0.043)，其余各癥狀不存在性別差異。見表1。

表1 不同性別的Gitelman綜合征患者臨床癥狀差異(n, %)Tab. 1 Differences in clinical symptoms of Gitelman syndrome patients by different genders (n, %)

2 實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 71例GS患者入院時均合并低鉀血癥，血鉀最低水平為(2.29±0.40) mmol/L，鉀離子排泄分?jǐn)?shù)為18.66%(11.13%，26.35%)。63例表現(xiàn)為代謝性堿中毒，平均動脈血pH為(7.44±0.27)，平均HCO3-為(29.04±2.72) mmol/L，平均剩余堿為(4.23±2.44) mmol/L?；颊呷朐汉笱V最低水平為(0.51±0.12) mmol/L，鎂離子排泄分?jǐn)?shù)4.15%(3.30%，6.46%)，16例(22.5%)無低鎂血癥。患者的尿鈣水平為0.63(0.40，1.13) mmol/24 h，尿鈣/肌酐為0.06(0.03，0.14) mmol/mmol，6例(8.4%)無典型低尿鈣。62例入院后行臥立位試驗(yàn)，多數(shù)表現(xiàn)為腎素-血管緊張素-醛固酮(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)系統(tǒng)激活?；颊吲P位血漿腎素活性(8.28±3.59) μg/(L·h)[正常范圍＜0.79 μg/(L·h)]，立位血漿腎素活性(9.49±4.16) μg/(L·h)[正常范圍0.93 ～ 8.58 μg/(L·h)]，臥位醛固酮水平為(556.46±427.17) pmol/L[正常范圍163.4 ～ 481.9 pmol/L]，立位醛固酮水平為(692.02±307.12) pmol/L[正常范圍180.1 ～ 810.9 pmol/L]。20例患者入院后行OGTT試驗(yàn)，結(jié)合患者既往史，10例(14%)有2型糖尿病，3例(4%)有糖耐量減低異常。此外，25例(35%)有脂肪肝，13例(18%)有高尿酸血癥，27例(38%)有血脂紊亂。男性患者較女性患者更易出現(xiàn)血脂紊亂和尿酸升高(P＜0.05)。見表2。

表2 不同性別的Gitelman綜合征患者一般情況和化驗(yàn)結(jié)果差異Tab. 2 Differences in general conditions and laboratory results of Gitelman syndrome patients by different genders

3 基因型特征 71例中3例未檢測到SLC12A3基因突變，1例疑似多個基因缺失，其余67例的基因突變散在分布于SLC12A3基因中。其中56例為復(fù)合雜合突變，3例為單雜合突變，8例為純合突變。所有患者中共檢測出70種不同突變類型(圖1)，錯義突變46種，內(nèi)含子突變7種，缺失插入突變6種，缺失突變5種，同義突變4種，插入突變2種，重復(fù)突變1種。11例有1種突變，48例有2種突變，5例有3種突變，3例有4種突變。p.D486N和p.T60M為本研究中最常見的突變位點(diǎn)，分別見于28%(20/71)和11%(8/71)的患者。本研究中共發(fā)現(xiàn)25種新發(fā)突變，其中錯義突變9種，缺失插入突變4種，同義突變4種，內(nèi)含子突變4種，缺失突變3種，插入突變1種。見表3。

表3 SLC12A3基因新發(fā)突變位點(diǎn)Tab. 3 New mutation sites of SLC12A3 gene

圖1 本研究中SLC12A3基因突變位點(diǎn)分布圖。本研究中共檢測出70種不同突變類型，其中25種為新發(fā)突變，用方框表示，超過1人擁有該突變用括號內(nèi)數(shù)字表示(不包含4個內(nèi)含子突變：c.965-1G＞A、c.1180 + 1G＞C、c.1444-2A＞G和c.2178 + 1G＞T)。p.D486N、p.T60M為本研究中最常見的突變位點(diǎn)Fig.1 Distribution of SLC12A3 gene mutation sites in this study. A total of 70 different mutation types were detected in this study, of which 25 were new mutations, represented by boxes, with more than one person having the mutation represented by a number in parentheses(excluding 4 intron mutations: c.965-1G＞A, c.1180 + 1G＞C, c.1444-2A＞G and c.2178 + 1G＞T). p.D486N and p.T60M were the most common mutation sites in this study

4 基因型與表型的關(guān)系 將GS患者按照復(fù)合雜合突變、單雜合突變和純合突變進(jìn)行分組，三組血鉀水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.049)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)純合突變患者的血鉀水平顯著低于復(fù)合雜合突變患者[(1.96±0.38) mmol/Lvs(2.33±0.38) mmol/L，P=0.015]，而確診年齡、血鎂、尿鈣等的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。將GS患者按照不同突變數(shù)目進(jìn)行分組，各組年齡、pH、HCO3-、血尿電解質(zhì)水平、排泄分?jǐn)?shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表5。

表4 不同突變類型Gitelman綜合征患者臨床數(shù)據(jù)差異Tab. 4 Differences in clinical data of Gitelman syndrome patients with different mutation types

表5 不同突變數(shù)目Gitelman綜合征患者臨床數(shù)據(jù)差異Tab. 5 Differences in clinical data of Gitelman syndrome patients with different numbers of mutations

討 論

GS為最常見的遺傳性腎小管疾病，主要發(fā)生于青春期和成年早期，GS患者的生活質(zhì)量遠(yuǎn)低于健康人群，因此對于該病的早期診斷和治療對于GS患者預(yù)后具有非常重要的意義。本研究對71例入院患者的臨床癥狀進(jìn)行分析，其臨床表現(xiàn)可累及多個系統(tǒng)，與王芬等[9]的研究相似，肢體乏力為最常見的臨床癥狀。GS最常累及系統(tǒng)為神經(jīng)肌肉系統(tǒng)，表現(xiàn)為肌無力、肢體麻木、肌肉抽搐等，主要與低鉀血癥和低鎂血癥相關(guān)。此外，GS還可累及心血管、消化、泌尿、骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)等，出現(xiàn)橫紋肌溶解、腎功能不全或致命的心律失常等嚴(yán)重癥狀。因此對于初次就診的GS患者應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)評估并及早干預(yù)，減少不良預(yù)后事件。有研究表明，男女患者的臨床表型存在異質(zhì)性，男性較女性有更嚴(yán)重的臨床表型，因?yàn)榕孕约に乜蓽p輕NCCT的功能缺失[10]。但本研究中，不同性別的GS患者在血尿電解質(zhì)方面的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但女性患者出現(xiàn)肌肉痙攣抽搐和肢體麻木癥狀的風(fēng)險高于男性，未來需要更大樣本量的研究來明確性別對于臨床表型的影響。

典型的GS表現(xiàn)為低鉀代謝性堿中毒伴低鎂血癥和低尿鈣，主要致病機(jī)制為NCCT功能缺陷導(dǎo)致腎單位遠(yuǎn)曲小管重吸收NaCl障礙，并可能激活RAAS系統(tǒng)，從而促進(jìn)了鉀離子和氫離子的分泌。低鎂血癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與腎遠(yuǎn)曲小管的主要結(jié)構(gòu)重塑及遠(yuǎn)曲小管頂端膜表達(dá)的瞬時受體電位M6通道(TRPM6)下調(diào)相關(guān)[11]。在GS患者中，正常血鎂患者的比例為8% ～ 22%，可以認(rèn)為是GS的一種亞型[12]。本研究中16例(22.5%)患者無明顯低鎂血癥。Jiang等[13]將7例正常血鎂患者與25例低鎂血癥患者進(jìn)行比較，正常血鎂患者的TRPM6表達(dá)接近正常，其臨床表現(xiàn)、電解質(zhì)異常、代償性堿中毒程度較輕。低尿鈣可能與遠(yuǎn)曲小管中瞬時受體電位V5通道介導(dǎo)的鈣重吸收增加有關(guān)，也可能與NCCT功能缺陷導(dǎo)致的成骨細(xì)胞分化和骨鈣儲存有關(guān)[14-15]。GS患者糖代謝異常的風(fēng)險增加，主要與慢性低鉀、低鎂抑制胰島素分泌并降低胰島素敏感度以及高醛固酮導(dǎo)致的胰島素抵抗相關(guān)[7]。本研究中GS患者2型糖尿病、高尿酸血癥和血脂紊亂的患病率高于普通人群，糾正患者電解質(zhì)紊亂是否可改善患者代謝水平仍需進(jìn)一步前瞻性研究。

Simon等[16]首次證明了SLC12A3基因?yàn)镚S的致病基因。但近年來研究表明，CLCNKB基因和HNF1B基因等其他致病基因突變也可能導(dǎo)致GS的發(fā)病[17-18]。本研究中共67例患者檢測到SLC12A3基因突變，以復(fù)合雜合突變居多，其次為純合突變，少數(shù)為單雜合突變，且純合突變患者的血鉀水平顯著低于復(fù)合雜合突變患者。p.D486N和p.T60M為我國人群最常見的突變位點(diǎn)，與既往研究結(jié)果一致[9,19]。此外，3例患者未檢測到SLC12A3基因突變，1例患者疑似多個基因缺失，表明還有其他遺傳因素在GS病理過程中發(fā)揮作用。未來可進(jìn)一步行全基因組測序探測SLC12A3以外致病基因的核苷酸序列變化。

綜上所述，GS患者臨床表現(xiàn)多不典型，最常累及神經(jīng)肌肉系統(tǒng)，以低血鉀、低血鎂、低尿鈣和RAAS系統(tǒng)激活為特征，部分患者血鎂和尿鈣水平正常。GS患者更易出現(xiàn)2型糖尿病、高尿酸血癥、血脂異常等代謝紊亂。本研究中共檢測出70種不同SLC12A3基因突變類型，其中25種為新發(fā)突變，p.D486N和p.T60M為最常見的突變類型，尚有其他遺傳因素在GS病理過程中發(fā)揮作用，有待于進(jìn)一步研究。