天門冬水提物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響

趙嘉寧梁惠玲楊 姁李艷菊王飛清陶奕汐王 琨嚴(yán)雪梅劉 洋*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴陽(yáng) 550025;2.貴州醫(yī)科大學(xué),貴陽(yáng) 550004;3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,貴陽(yáng) 550001)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)高發(fā)的惡性腫瘤,由于其起病較隱匿、發(fā)病時(shí)多已屬中晚期,預(yù)后較差。 據(jù)最新全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,結(jié)直腸癌是男性第三、女性第二高發(fā)腫瘤,一般人群累計(jì)終生風(fēng)險(xiǎn)為5%,惡性致死率排名第三[1-2]。 在中國(guó),結(jié)直腸癌死因排位上升到第5 位,且呈年輕化趨勢(shì)[3],這給患者、家庭乃至整個(gè)國(guó)家?guī)?lái)了巨大的身體和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。 眾所周知,化學(xué)療法的毒副反應(yīng)較大,而新興的靶向治療方法面臨耐藥性和價(jià)格昂貴的嚴(yán)峻挑戰(zhàn),因此,開發(fā)具有多種化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用的天然抗腫瘤藥物與治療腫瘤疾病需求的殷切期盼不謀而合[5]。 天門冬是百合科植物天冬(asparagus cochinchinensis (Lour) Merr)的塊根[6],是我國(guó)一種傳統(tǒng)中草藥,《神龍本草經(jīng)》將其歸為上品,記載此藥主風(fēng)濕偏痹,強(qiáng)骨髓,殺三蟲,去浮尸,言久服輕生益氣延年,當(dāng)代臨床常用于治療陰虛發(fā)熱、咳嗽吐血、肺癰、咽喉腫痛、消渴、便秘等病癥。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究從天門冬分離出天門冬素、甾體皂苷、低聚糖和多糖類等多種成分[7-8],據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道這些成分具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤活性等藥理作用,且?guī)缀鯇?duì)人體沒(méi)有毒副反應(yīng)[9-11]。目前有關(guān)天門冬抗腫瘤作用的研究主要集中在單體及粗提物通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、周期阻滯,抑制其增殖、遷移、腫瘤生長(zhǎng),延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期等方面[12-15],然而有關(guān)天門冬對(duì)人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的影響報(bào)道尚屬空白。 本研究評(píng)價(jià)了天門冬水提取物對(duì)人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲的抑制及促進(jìn)凋亡等作用效果,旨為天門冬的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞系由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所提供。

1.2 主要試劑與儀器

天門冬(貴陽(yáng)濟(jì)仁堂藥業(yè)有限公司);高糖DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó) GIBCO 公司, 批號(hào)2200905); 胎牛血清(以色列 BI 公司, 批號(hào)1706126);PBS 緩沖液(北京索萊寶公司,批號(hào)422R023);青/鏈霉素混合液(北京索萊寶公司,批號(hào) 20201023);胰酶細(xì)胞消化液(南京碧云天公司,批號(hào) 70120500);二甲基亞砜(北京索萊寶公司,批號(hào) 710N0317);4%多聚甲醛(北京索萊寶公司,批號(hào)70085400);結(jié)晶紫染料(北京索萊寶公司,批號(hào)20191119);細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒CCK-8(日本同仁公司);EdU/Hoechst 33342 試劑盒(廣州銳博公司,批號(hào) S0626);Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技公司, 批號(hào)20210727);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司);氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);引物合成、DEPC 處理水(上海生物工程有限公司)。

CO2恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo 公司);超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);低速離心機(jī)、微量移液器(德國(guó)Eppendorf 公司);流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD 公司);倒置顯微鏡、熒光顯微鏡BX53(日本Olympus 公司);PCR 擴(kuò)增儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司);6 孔培養(yǎng)板、48 孔培養(yǎng)板、96 孔培養(yǎng)板、Transwell 小室(美國(guó)Corning 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 天門冬水提取物制備

精密稱取天門冬飲片50 g,加10 倍體積水稱重,浸泡2 h,回流提取2 次,每次1 h,抽濾,合并濾液,用水補(bǔ)足減少的重量,藥液在70℃減壓濃縮,濃縮至含生藥1 g/mL 濃度,取濃縮液2 mL 加水稀釋至10 mL,1000 r/min 離心5 min,上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,濾液分裝于無(wú)菌離心管,置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?天門冬水提取物的制備方法參考了先前的研究[16-17]。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞培養(yǎng)于添加100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素、10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2的恒溫加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2～3 d 以1 ∶3 的比例傳代1 次。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 CCK-8 檢測(cè)天門冬水提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 增殖的影響

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HCT116 細(xì)胞接種于96 孔板中,接種密度為6×103個(gè)/孔,置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后,去除原培養(yǎng)基,添加含不同濃度的天門冬水提取物的完全培養(yǎng)基,各組對(duì)應(yīng)濃度分別為25、50、100、150、200 μg/mL,并設(shè)置空白對(duì)照組(control),每個(gè)藥物濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,96 孔板周圍一圈均每孔加入200 μL PBS 溶液,培養(yǎng)24、48 或72 h,換液,每孔加入含10% CCK-8 的完全培養(yǎng)基100 μL,培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。 用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的OD 值。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,記錄每塊板的數(shù)值,并計(jì)算IC50及抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%

1.3.4 結(jié)晶紫染色

待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～90%融合度時(shí),消化收集細(xì)胞,按細(xì)胞密度為每毫升1×105個(gè)的要求在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行接種,37℃,5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞融合度達(dá)50%時(shí)開始加藥,以完全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組,分別加入50、100、200 μg/mL(依據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定此濃度為余下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度)天門冬水提取物的完全培養(yǎng)基作用24 h。 PBS 洗滌2 遍,4%多聚甲醛固定20 min,PBS 洗滌2 遍,1%結(jié)晶紫染色15 min,自來(lái)水洗去多余結(jié)晶紫染料,室溫自然晾干后在倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)行觀察分析、拍照。

1.3.5 集落形成實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞密度為700 個(gè)/孔生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HCT116 細(xì)胞接種到6 孔板中,37℃,5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,吸棄舊培養(yǎng)基,給藥組分別加入含50、100、200 μg/mL 濃度天門冬水提取物培養(yǎng)基,對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基,每3 d 換液1 次,待細(xì)胞集落形成合適大小時(shí)(藥物處理14 d),吸棄條件培養(yǎng)基,PBS 洗滌2 次,然后將細(xì)胞集落固定在4%多聚甲醛中20 min,棄液后PBS 洗滌2 次,結(jié)晶紫溶液染色15 min,吸棄染色液,PBS 洗滌2～3 次,室溫自然晾干,用光鏡計(jì)數(shù)含有50 個(gè)以上細(xì)胞的集落數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 EdU 染色檢測(cè)細(xì)胞DNA 合成率

將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞按每毫升2×104個(gè)細(xì)胞懸液接種在48 孔板中,待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)50%時(shí),吸棄舊培養(yǎng)基,添加含50、100、200 μg/mL 天門冬水提取物的完全培養(yǎng)基,對(duì)照組添加完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,加入1000 ∶1 濃度的EdU 標(biāo)記液在37℃溫箱內(nèi)孵育2 h。 PBS 洗滌細(xì)胞2 次,4%多聚甲醛中固定30 min,2 μg/mL 甘氨酸溶液中搖床孵育5 min,PBS 洗滌5 min,0.5% TritonX-100 搖床10 min,PBS 洗滌5 min,熒光染料避光孵育30 min,PBS 每次洗滌10 min,共3 次。 然后用倒置熒光顯微鏡成像。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,并對(duì)每個(gè)孔中至少10 個(gè)來(lái)自3 個(gè)位置的細(xì)胞進(jìn)行拍照、分析。

DNA 合成率=(紅色熒光細(xì)胞數(shù)/藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù))×100%

1.3.7 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HCT116 細(xì)胞消化并計(jì)數(shù),按為每毫升1×105個(gè)細(xì)胞密度求接種于6 孔板中,放入CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)加入相應(yīng)藥物濃度的條件培養(yǎng)基,藥物作用24 h 后使用不含EDTA 的胰酶消化,消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),2000 r/min 離心5 min,收集細(xì)胞,并用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2 次,每個(gè)樣品管加入500 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞,加入Annexin V-FITC/PI熒光染料,避光反應(yīng)5 min 后,利用流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,FlowJo 10.0 軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.3.8 傷口愈合試驗(yàn)

用傷口愈合法測(cè)定細(xì)胞遷移率,將2×105個(gè)/孔細(xì)胞接種到6 孔板上,在37℃溫箱、完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。 天門冬水提取物與不含F(xiàn)BS 的新鮮培養(yǎng)基配置成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度,將單層劃傷,分別在不同藥物濃度環(huán)境中孵育24 h。 在倒置顯微鏡下拍攝了6 個(gè)不同的位置,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 用Image J 軟件分析傷口面積。

1.3.9 Transwell 侵襲試驗(yàn)

將各濃度組處理24 h 并饑餓24 h 的HCT116細(xì)胞(5×104個(gè)/孔)重懸于200 μL 的無(wú)FBS 高糖DMEM 培養(yǎng)基中,接種到上室內(nèi)(有基質(zhì)凝膠涂層膜),下室加入600 μL 含20%FBS 完全培養(yǎng)基,孵育24 h 后,用棉簽從膜上表面取出未侵入的細(xì)胞,侵入細(xì)胞固定,結(jié)晶紫染色,倒置顯微鏡拍照,每組隨機(jī)6 各視野。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,Image J 軟件計(jì)數(shù)。1.3.10 Real-time PCR 檢測(cè)p53、Bax基因表達(dá)

取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期HCT116 細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)藥物濃度組接種細(xì)胞于6 孔板中,每組3 個(gè)復(fù)孔,處理24 h。 用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次,TRIzol 法提取總RNA,按TRIzol 試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 溶液濃度和純度。 取總RNA 1 μL按要求逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。 再以此為模版,按25 μL 體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)。 以GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參,反應(yīng)條件為:95℃ 5 s,59℃ 20 s,72℃20 s,40 cycles。 Melt curve:95℃ 5 s,65℃ 5 s,60 cycles。 結(jié)果通過(guò)PCR 儀記錄的Ct 值對(duì)起始模板相對(duì)定量分析,每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,用Graph Pad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。 數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,獲得數(shù)據(jù)分析為正態(tài)性分布,多組間比較采用單因素方差分析,當(dāng)P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 天門冬水提取物抑制HCT116 細(xì)胞的增殖

CCK-8 法檢測(cè)天門冬水提取物對(duì)HCT116 細(xì)胞活性的影響,結(jié)果如(圖1)所示,天門冬水提取物以濃度和時(shí)間依賴性方式抑制HCT116 細(xì)胞的活性,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 通過(guò)Graph Pad Prism 8 軟件計(jì)算其24 h 半抑制濃度IC50為(200.17±12.08)μg/mL,結(jié)果表明天門冬水提取物在24 h 已發(fā)揮抑制HCT116 細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,接下來(lái)我們的實(shí)驗(yàn)均采取天門冬水提取物濃度為50、100、200 μg/mL,以0 μg/mL 作為空白對(duì)照組,處理時(shí)間為24 h 的干預(yù)條件。

圖1 各組細(xì)胞12～72 h 細(xì)胞存活率Note. Compared with the control group, **P＜0.01.Figure 1 12～72 h cell survival rate of cells in each group

結(jié)晶紫染色觀察到隨著天門冬水提取物濃度的增加,細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,貼壁不牢,細(xì)胞皺縮,出現(xiàn)不同程度的核固縮,細(xì)胞核內(nèi)空泡化(圖2)。

圖2 天門冬水提取物對(duì)HCT116 細(xì)胞形態(tài)的影響Note. A, Control group. B, Asparagus 50 μg/mL. C, Asparagus 100 μg/mL. D, Asparagus 200 μg/mL.Figure 2 Effect of the water extract of asparagus on HCT116 cells morphology

集落形成試驗(yàn)結(jié)果表明,藥物組的集落數(shù)明顯低于空白對(duì)照組(圖3),且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示天門冬水提取物對(duì)HCT116 細(xì)胞的集落形成能力有明顯抑制作用。

圖3 各組細(xì)胞克隆形成能力比較Note. A, Control group. B, Asparagus 50 μg/mL. C, Asparagus 100 μg/mL. D, Asparagus 200 μg/mL. Compared with the control group, **P＜0.01.Figure 3 Comparison of cell clone formation ability in each group

EdU/Hoechst 33342 熒光雙染法結(jié)果如(圖4)所示,在天門冬水提取物中培養(yǎng)24 h 的細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比隨濃度梯度顯著減少,EdU 相對(duì)熒光強(qiáng)度百分率隨濃度增加顯著降低,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 表明天門冬水提取物對(duì)HCT116細(xì)胞的DNA 合成能力有明顯抑制作用。

圖4 各組EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率比較Note. A, Control group. B, Asparagus 50 μg/mL. C, Asparagus 100 μg/mL. D, Asparagus 200 μg/mL. Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 4 Comparison of EdU positive cell rate in each group

2.2 天門冬水提取物促進(jìn)HCT116 細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析結(jié)果表明,50、100、200 μg/mL 的天門冬水提取物均可促進(jìn)HCT116 細(xì)胞凋亡,且呈濃度依賴性,總凋亡率分別為(4.20 ±0.19)%、(6.68 ± 0.04)%、(12.45 ± 0.17)%,與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),其中早期凋亡率較對(duì)照組增加,且差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),晚期凋亡率與對(duì)照組相比,100、200 μg/mL 組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖5)。

圖5 各組細(xì)胞凋亡比較Note. A, Control group. B, Asparagus 50 μg/mL. C, Asparagus 100 μg/mL. D, Asparagus 200 μg/mL. Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure5 Comparisonofapoptosisofcellsineachgroup

Real-time PCR 結(jié)果表明,隨著天門冬水提取物濃度的增加,凋亡相關(guān)基因p53、Bax的mRNA 表達(dá)水平升高,與空白對(duì)照組比較,100、200 μg/mL 組差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖6)。

圖6 各組細(xì)胞中p53、Bax 基因mRNA 表達(dá)水平變化Note. Compared with the control group, **P＜0.01.Figure 6 Changes in the expression of mRNA levels of p53 and Bax genes in cells of each group changed

2.3 天門冬水提取物抑制HCT116 細(xì)胞的遷移和侵襲

天門冬水提取物處理HCT116 細(xì)胞24 h 后,傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,劃傷24 h 后,隨著藥物濃度的增加,其遷移率逐漸降低,具體結(jié)果如(圖7)所示,各濃度組與control 組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。 提示天門冬水提取物能抑制HCT116細(xì)胞的遷移能力。

圖7 天門冬水提取物對(duì)HCT116 細(xì)胞遷移能力的影響Note. A, Control group. B, Asparagus 50 μg/mL. C, Asparagus 100 μg/mL. D, Asparagus 200 μg/mL. Compared with the control group, **P＜0.01.Figure 7 Effect of asparagus on the migration ability of colon cancer HCT116 cell

Transwell 侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度的天門冬水提取物均能抑制HCT116 細(xì)胞的侵襲能力,且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示在HTC116 細(xì)胞侵襲能力方面,各天門冬水提取物濃度組與control 組之間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)(圖8)。

圖8 天門冬水提取物對(duì)HCT116 細(xì)胞侵襲能力的影響Note. A, Control group. B, Asparagus 50 μg/mL. C, Asparagus 100 μg/mL. D, Asparagus 200 μg/mL. Compared with the control group, **P＜0.01.Figure 8 Effect of asparagus on the invasion ability of colon cancer HCT116 cell

3 討論

結(jié)直腸癌的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,大抵是患者正氣虧損,邪毒侵襲,導(dǎo)致氣滯、痰凝、濕聚等病理變化所致,是一個(gè)整體為虛,局部為實(shí)的全身性疾病。 臨床研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者大多出現(xiàn)免疫抑制[18],這種免疫功能紊亂可對(duì)應(yīng)中醫(yī)“正氣虛損”的微環(huán)境。 基于此,扶正法是中醫(yī)理論中非常重要的治療大法,劉嘉湘教授主張[19]“扶正治癌”,認(rèn)為準(zhǔn)確辨證、嚴(yán)守病機(jī),立足扶正,據(jù)實(shí)祛邪,把握疾病的主要矛盾和矛盾的主要方面,讓扶正與祛邪有機(jī)結(jié)合,如此可掌握治療腫瘤的主動(dòng)權(quán)。 所以近年來(lái)益氣扶正類中藥在惡性腫瘤治療中的研究與應(yīng)用越來(lái)越受到重視[20-22]。

天冬始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,包含天門冬素、甾體皂苷、低聚糖和多糖類等多種成分[6-7],具有清熱、養(yǎng)肺腎陰的功效。 天冬除了顯著的抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等作用,亦被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性。臨床常采用以天門冬等中藥組成的復(fù)方治療惡性腫瘤性疾病[23],其能夠發(fā)揮穩(wěn)定病灶、改善生存質(zhì)量及延長(zhǎng)生存期等功效。 研究發(fā)現(xiàn)天門冬皂苷提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞[24]有顯著的細(xì)胞毒性作用,Bousserouel 等[13]結(jié)果更詳細(xì)地表明,ASP 的甲醇提取物可以通過(guò)激活人結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480 和SW620 的TRAIL 死亡受體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 程偉[25]研究表明天冬多糖體在外常氧和缺氧下可抑制人肝癌細(xì)胞(SK-Hep1 和Hep-3B) HIF1α 和VEGF 表達(dá),從而抑制人肝癌細(xì)胞(SK-Hep1 和Hep-3B)增殖、遷移、侵襲和血管形成。 本課題以天門冬水提物為研究對(duì)象,因前期藥物分析發(fā)現(xiàn),天門冬水提物主要活性成分包括總皂苷、多糖、槲皮素、β-谷甾醇和7-甲氧基-2-甲基異黃酮,故天門冬水提物可能具有多效協(xié)同抑制結(jié)直腸癌增殖的作用,且天門冬水提物獲取程序較簡(jiǎn)化,易于臨床廣泛推廣[26]。

本研究采用人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞為載體,通過(guò)CCK-8 法、集落形成實(shí)驗(yàn)、EdU 熒光染色法檢測(cè)天門冬水提取物對(duì)HCT116 細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明,天門冬水提取物可有效抑制HCT116 細(xì)胞增殖,并呈一定的時(shí)間和濃度依賴性。

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death,PCD),在大多數(shù)惡性腫瘤發(fā)病學(xué)上占有重要地位。 Liu 等[27]用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析,評(píng)價(jià)天門冬皂苷G(7)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,隨著天門冬皂苷濃度的增加,肺癌細(xì)胞NCIH460 的凋亡細(xì)胞的百分比增加,天門冬皂苷可呈劑量依賴性地促進(jìn)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H460 的凋亡,從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。 本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)天門冬水提物對(duì)HCT116 細(xì)胞的抑制作用,結(jié)果顯示經(jīng)天門冬水提物處理后,細(xì)胞凋亡率隨濃度升高而升高。 另外,通過(guò)傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)MHCT116 細(xì)胞的侵襲遷移狀況,結(jié)果顯示天門冬水提取物干預(yù)HCT116細(xì)胞后,遷移距離減少,細(xì)胞侵襲穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少。 提示天門冬水提物可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡,并以濃度依賴方式明顯抑制人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

p53 基因是腫瘤領(lǐng)域研究最為廣泛的基因之一,大多數(shù)人類腫瘤與其變化有關(guān)[28]。Bax是Bcl-2 基因家族的成員,通過(guò)剪切露出BH3 結(jié)合域,釋放細(xì)胞色素C,激活細(xì)胞內(nèi)Caspase 酶原,其表達(dá)量增多往往導(dǎo)致細(xì)胞凋亡加速[29]。 近年研究發(fā)現(xiàn),Bax基因是p53 的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)[30],Bax基因表達(dá)上調(diào)可能是由激活的p53 誘導(dǎo)的。 薯蕷皂苷元是天冬抗腫瘤的活性成分,有研究表明其能抑制乳腺癌生存和增殖,主要是通過(guò)增強(qiáng)p53 蛋白表達(dá),抑制核因子-κB(NF-κB)與DNA 結(jié)合和p38 有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAKP)的活化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31]。 本研究發(fā)現(xiàn),天門冬水提物可上調(diào)HCT116 細(xì)胞p53和Bax的mRNA 表達(dá)水平,提示天門冬水提物可調(diào)控凋亡相關(guān)因子,促進(jìn)HCT116 細(xì)胞的凋亡,且其對(duì)信號(hào)分子的調(diào)控具有一定的劑量依賴性趨勢(shì)。

中藥復(fù)方現(xiàn)代研究中,由于水與乙醇的極性不同,醇提取物和水提取物有效成分的含量、種類存在差異[32],考慮到醇提法的成本及對(duì)工人的毒性,本研究以水作為提取溶劑,提高提取效率的同時(shí)的保留了天冬中的多糖和總氨基酸等活性成分,在誘導(dǎo)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面,取得了較好的結(jié)果[33-35]。 本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞系HCT116 為研究對(duì)象,通過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)基因p53、Bax表達(dá)的檢測(cè),發(fā)現(xiàn):一定濃度的天門冬水提取物能夠上調(diào)HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞p53、BaxmRNA 的表達(dá)、誘導(dǎo)HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,降低其遷移、侵襲能力,具有較好的抗腫瘤潛力,其機(jī)制可能與上調(diào)Bax、p53 的表達(dá)有關(guān),進(jìn)而為扶正類中藥水提物治療結(jié)腸癌提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為其后期的研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。