楊 燦，曹昺焱，張廣德

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

2型糖尿病以慢性血糖升高為主要特征。研究表明,我國20歲以上的人群患有糖尿病的人數(shù)占總?cè)丝诘?.7%[1]。由于2型糖尿病可增加冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病風(fēng)險[2]，研究該病的中醫(yī)治療具有較大的社會和經(jīng)濟意義。

課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，電針可降低2型糖尿病大鼠空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，改善胰島素抵抗，其機制可能與調(diào)控胰島素受體底物1(Insulin receptor substrate-1，IRS-1)磷酸化水平有關(guān)[3]。本研究旨在對電針調(diào)控2型糖尿病大鼠骨骼肌IRS-1絲氨酸磷酸化的機制進行深入的研究，從電針下調(diào)c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路活性、抑制IRS-1絲氨酸磷酸化和促進胰島素信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度對電針的干預(yù)機理進行解釋。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

實驗動物為18只(2月齡)SPF(Specific Pathogen Free)級ZDF(Zucker Diabetic Fatty)大鼠和8只同月齡的ZL(Zucker Lean)大鼠,體質(zhì)量(150±10)g。全部動物購自北京維通利華公司[SCXK(京)2016-0006]。動物于23 ℃、相對濕度60%的通風(fēng)環(huán)境中，于12 h晝夜循環(huán)光照的條件下飼養(yǎng)。全部動物于1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后開始以Purina #5008飼料喂養(yǎng)6周，誘導(dǎo)造模。飼養(yǎng)期間如無特殊需要，動物自由飲食水。

1.2 儀器和試劑

離心機：Legend micr017r(Thermo公司)；針灸針(LOT 212161123，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；羅氏ACCU-CHEK 血糖儀(LOT 10129770，羅氏血糖健康醫(yī)護公司)；羅氏血糖試紙(LOT 24685431，羅氏血糖健康醫(yī)護公司)；蛋白磷酸酶抑制劑混合物(LOT 01392/60333，普利萊公司)；IRS-1及phospho-IRS-1 ser307抗體(#2381，cell signaling公司)；Phospho-SAPK/JNK(thr183/tyr185)Antibody(#4668，Cell Signaling公司)。

2 實驗方法

2.1 模型評估

全部動物以Purina #5008飼料喂養(yǎng)6周后，禁食過夜，以羅氏血糖儀和試紙檢測空腹血糖。以空腹血糖>11.1 mmol/L為成模標準。全部18只ZDF大鼠均符合成模標準。

2.2 動物分組

8只ZL大鼠作為空白組。18只成模ZDF大鼠按誘導(dǎo)喂養(yǎng)6周后的空腹血糖隨機分為模型組和電針組。

2.3 干預(yù)方法

2.3.1 空白組及模型組 不干預(yù)。

2.3.2 電針組 將動物固定于可伸出四肢的棉布鼠套中靜置5 min,待動物適應(yīng)后，以0.22 mm×13 mm針灸針針刺雙側(cè)“后三里” “三陰交” “脾俞” “胃脘下俞”，并連通電針儀(電針陽極連接于“脾俞”，陰極連同側(cè)“三陰交”形成回路，雙側(cè)均接通電針)。電針參數(shù)：連續(xù)波，頻率15 Hz，電流輸出強度2 mA，留針20 min，每日1次，6次/周(周一至周六)，6周。取穴位置和針刺深度:“后三里”取大鼠后肢腓骨小頭下方5 mm處，直刺4～6 mm;“三陰交”取大鼠后肢內(nèi)踝尖直上10 mm處，直刺4 mm;“脾俞”取大鼠第11胸椎棘突下旁開7 mm處，向后正中線斜刺4 mm;“胃脘下俞”取大鼠第8胸椎棘突下旁開7 mm處，向后正中線斜刺4 mm[4-6]。

2.4 指標檢測

2.4.1 空腹血糖 于末次干預(yù)結(jié)束當(dāng)天，全部動物禁食過夜，次日早8:00以羅氏血糖儀檢測空腹血糖。

2.4.2 空腹胰島素 動物檢測空腹血糖后，按45 mg/kg的藥量比腹腔注射2%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹主動脈取血致死。大鼠血液于室溫環(huán)境靜置30 min后，于4 ℃條件下以3 000 r/min速度離心15 min分離血清。以放射免疫法檢測空腹胰島素含量,檢測過程委托北京華英生物技術(shù)研究所完成。1只電針組大鼠于干預(yù)過程中死亡，1只空白組大鼠因取材過程中溶血，未能準確檢測出空腹胰島素含量。

2.4.3 胰島素抵抗指數(shù) HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

2.4.4 骨骼肌p-JNK及p-IRS-1 Ser307蛋白表達 動物取血致死后，迅速于冰浴環(huán)境下取同部位股四頭肌100 mg，加入1 mL混合蛋白磷酸酶抑制劑混合物的裂解液勻漿。將勻漿液于冰上靜置30 min(每5 min渦旋振蕩1次)，在4 ℃環(huán)境下以10 000 r/min速度離心15 min，取上清液配平、煮沸變性后，上樣(檢測p-IRS-1 Ser307時用6%分離膠，檢測p-JNK及GAPDH內(nèi)參時用10%分離膠)，以80 V、60 min為條件電泳；以100 V、90 min為條件將蛋白濕轉(zhuǎn)至0.45 μm孔徑的PVDF膜上，以加入5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉90 min后，一抗孵育過夜。次日經(jīng)洗膜、二抗孵育后，使用Ecl發(fā)光液于暗室曝光。

數(shù)據(jù)處理：以Image-Pro Plus6.0軟件計算條帶IOD(Integrated option density，總灰度值)作為表達量。以GAPDH和IRS-1為內(nèi)參，計算p-JNK及p-IRS-1 Ser307的相對表達量。本檢測重復(fù)3次，以平均值進行統(tǒng)計分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 電針對2型糖尿病大鼠空腹血糖的調(diào)控作用

經(jīng)過低頻電針干預(yù)，模型組與電針組大鼠空腹血糖仍顯著高于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；但與模型組比較，電針組大鼠空腹血糖有顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示低頻電針“后三里” “三陰交” “脾俞” “胃脘下俞”穴組可顯著下調(diào)2型糖尿病模型大鼠空腹血糖。見表1。

表1 電針對2型糖尿病大鼠空腹血糖的調(diào)控作用

3.2 電針對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的調(diào)控作用

低頻電針干預(yù)可顯著降低2型糖尿病模型大鼠激增的HOMA-IR，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但無法將該指標降低到與空白組動物無差異的程度。模型組與電針組的HOMA-IR仍顯著高于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 電針對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗指數(shù)的調(diào)控作用

3.3 電針對2型糖尿病大鼠骨骼肌p-JNK(thr183/tyr185)蛋白表達的調(diào)控

2型糖尿病大鼠骨骼肌p-JNK(thr183/tyr185)含量較空白組顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，JNK通路異常活躍。低頻電針干預(yù)可顯著降低模型動物骨骼肌p-JNK(thr183/tyr185)蛋白表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，對JNK通路有明顯的抑制作用。見表3、圖1。

表3 電針對骨骼肌p-JNK(thr183/tyr185)蛋白表達的調(diào)控作用

3.4 電針對2型糖尿病大鼠骨骼肌p-IRS-1 Ser307蛋白表達的調(diào)控

2型糖尿病大鼠骨骼肌p-IRS-1 Ser307蛋白表達較空白組顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型動物骨骼肌IRS-1絲氨酸磷酸化異?；钴S。電針可顯著下調(diào)大鼠骨骼肌p-IRS-1 Ser307蛋白表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，抑制骨骼肌中異?；钴S的IRS-1絲氨酸磷酸化。見表4、圖1。

表4 電針對骨骼肌p-IRS-1 Ser307蛋白表達的調(diào)控作用

圖1 2型糖尿病大鼠骨骼肌JNK通路指標的Western blot檢測結(jié)果

4 討論

4.1 從脾論治取穴符合2型糖尿病胰島素抵抗的特性

2型糖尿病以胰島素分泌不足和肝、脂肪、骨骼肌等胰島素靶器官對胰島素敏感性下降(胰島素抵抗)為機制。其中，胰島素抵抗是發(fā)病的主要原因[7]。在胰島素的各類靶細胞中，骨骼肌攝取血循環(huán)中約80%的葡萄糖，是胰島素抵抗的主要發(fā)生場所。由于脾主四肢肌肉，中醫(yī)多從脾論治2型糖尿病。如《靈樞·五味》所言：“谷始入于胃，其精微者，先出于胃之兩焦，以溉五藏，別出兩行，營衛(wèi)之道?！彼染⒊鲇谖福善⑤敳?，成為營衛(wèi)二氣。營行脈中，衛(wèi)行脈外，二者共同濡養(yǎng)四肢百骸、筋骨肌肉。脾的功能健全，則精微物質(zhì)得以敷布全身、肌肉豐滿和動作有力。在病理狀態(tài)下，如《素問·太陰陽明論》篇言:“帝曰：脾病而四支不用，何也？岐伯曰：四支皆稟氣于胃，而不得至經(jīng)，必因于脾，乃得稟也。今脾病不能為胃行其津液，四支不得稟水谷氣，氣日以衰，脈道不利，筋骨肌肉皆無氣以生，故不用焉”。脾失健運，水谷精微生化不足或不能運達濡養(yǎng)四肢，可見四肢乏力、倦怠疲乏等癥狀。這種病理變化也對應(yīng)2型糖尿病患者由于骨骼肌胰島素抵抗，在胰島素刺激下不能有效地攝取葡萄糖，導(dǎo)致外周血循環(huán)中血糖過高，而肌肉卻因缺乏葡萄糖攝取而易疲乏無力。故取與脾密切相關(guān)的足三里、三陰交、脾俞和胃脘下俞，可以調(diào)理脾氣，促進其運化功能，改善胰島素抵抗狀態(tài)，降低血糖。

筆者通過前期研究發(fā)現(xiàn)，以“脾俞” “后三里”等與脾相關(guān)的穴位對T2DM模型大鼠進行電針干預(yù)，能有效降低空腹血糖[8-9]，同時改善總膽固醇、血清甘油三酯和低密度脂蛋白[10]等指標，且顯著改善胰島素抵抗指數(shù)和胰島素敏感指數(shù)[11]。近年來有研究者通過回顧既往以針灸療法治療2型糖尿病的文獻發(fā)現(xiàn)，諸多醫(yī)家均采用了從脾胃論治2型糖尿病的觀點：2001年—2011年的79篇與針灸療法治療2型糖尿病相關(guān)的文獻中，單穴使用頻次從高到低依次為：三陰交、足三里、脾俞、腎俞和胃脘下俞[11]。這與課題組前期研究結(jié)果相契合。

4.2 胰島素信號通路與骨骼肌胰島素抵抗

由于葡萄糖不能通過自由擴散的形式進入骨骼肌細胞，骨骼肌對葡萄糖的攝取主要經(jīng)過胰島素信號刺激，最終激活葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(Glucose transporter 4，GLUT4)實現(xiàn)，使骨骼肌在胰島素信號的刺激下攝取葡萄糖。因此，電針調(diào)控骨骼肌胰島素抵抗的起效機制應(yīng)與其對胰島素信號通路的調(diào)控有關(guān)。

其通路機制為：經(jīng)外周血運輸來的胰島素與骨骼肌細胞膜上的胰島素受體(Insulin Receptor，InR)結(jié)合，激活I(lǐng)nR，進而催化IRS活性[12]。IRS-1和IRS-2兩種亞型在信號傳導(dǎo)中起主要作用，骨骼肌以IRS-1為主。IRS-1有多個磷酸化位點。IRS-1酪氨酸磷酸化會為含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白(其中就包括磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K))提供特異性對接位點。PI3K可以通過PI3K-Akt 通路激活GLUT4，使其從囊泡移位至細胞膜[13-14]，發(fā)揮生物活性。即IRS-1的酪氨酸磷酸化會對胰島素信號通路起促進作用。

IRS-1同時還存在絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化位點，且IRS-1的酪氨酸磷酸化與絲/蘇氨酸磷酸化之間存在競爭關(guān)系。因此，IRS-1的胰島素抵抗常伴隨IRS-1 的酪氨酸磷酸化水平降低或絲/蘇氨酸磷酸化水平異常增高。研究表明多種T2DM致病因素如糖毒性、脂毒性、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等都可以通過損害IRS-1酪氨酸磷酸化或促進IRS-1絲/蘇氨酸磷酸化競爭性地抑制酪氨酸磷酸化，阻礙胰島素信號向下游PI3K-Akt-GLUT4通路傳遞，造成胰島素抵抗[15]。研究證實T2DM患者存在IRS表達及酪氨酸磷酸化水平降低[16]；多種實驗表明不同治療方法都可有效提升骨骼肌中IRS酪氨酸磷酸化水平，從而改善胰島素抵抗[17-18]。

4.3 JNK影響IRS-1磷酸化的機制

目前研究表明，細胞內(nèi)JNK通路的活化可以促進IRS-1絲氨酸磷酸化。研究[19]證實：各種上游因子誘導(dǎo)的JNK信號通路活化，能夠介導(dǎo)IRS-1絲氨酸位點發(fā)生磷酸化，使IRS-1的酪氨酸磷酸化位點活性受到抑制；而p-JNK的缺乏可以有效抑制胰島素抵抗和胰島B細胞功能障礙[20]。在進行高糖高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型的肝、肌肉和脂肪等胰島素的靶器官中，JNK的含量和活性均顯著提升；而在敲除JNK1基因后，動物的肥胖和胰島素抵抗狀態(tài)均可得到顯著的改善[21]。這種作用據(jù)推測是通過抑制JNK下游的IRS-1絲氨酸磷酸化實現(xiàn)的[22]。在高糖濃度下培養(yǎng)INS-1細胞，其p-JNK及p-IRS-Ser-270絲氨酸磷酸化水平顯著增加，加入JNK抑制劑后，JNK磷酸化被抑制，IRS絲氨酸磷酸化水平降低，INS-1細胞活性改善，凋亡減少，表明JNK磷酸化對IRS-1介導(dǎo)的胰島素信號傳導(dǎo)存在負反饋作用，抑制JNK磷酸化可有效保護胰島細胞，改善胰島素抵抗[23]。早期的細胞實驗發(fā)現(xiàn)，胰島素?zé)o法在缺少IRS-1的細胞中刺激JNK，其激活途徑可能與PI3K的激活及Ras-MEK1/2-ERK1/2 級聯(lián)有關(guān)，IRS-1僅與激活后的JNK結(jié)合，在Ser307磷酸化中起主要作用，從而減少酪氨酸磷酸化，形成胰島素信號傳導(dǎo)反饋抑制[24]。而JNK的激活并不會因為胰島素抵抗的發(fā)展而降低，是因為PI3K/AKT通路受酪氨酸磷酸化降低的影響下調(diào)，而MAPK通路不受影響甚至代償性上調(diào)。隨后有研究發(fā)現(xiàn)，IRS-1殘基307的突變能夠阻止JNK1磷酸化，但不能阻止小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，只有多個位點發(fā)生突變時才能改善，說明JNK1可能與IRS-1的多個位點相結(jié)合共同作用[25]。

5 總結(jié)

本研究中，低頻電針“后三里” “三陰交” “脾俞” “胃脘下俞”穴組可以降低2型糖尿病模型動物血糖，改善胰島素抵抗，并可降低骨骼肌p-JNK(thr183/tyr185)和p-IRS-1 ser307水平。因此得出結(jié)論：電針可以通過降低骨骼肌JNK通路活性，抑制其介導(dǎo)的IRS-1絲氨酸磷酸化，控制IRS-1絲氨酸磷酸化對酪氨酸磷酸化的競爭性抑制，從而促進胰島素信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，上調(diào)骨骼肌攝取葡萄糖的能力，改善胰島素抵抗，降低血糖。