許文婷,薛玉滿,王 策,孔 瑩△,鄒 偉,4△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.成都中醫(yī)藥大學,四川 成都 610075； 4.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是神經(jīng)內(nèi)科的常見病、多發(fā)病，病情危重，致殘率和病死率均較高，其發(fā)病率隨著人口老齡化加劇而逐年上升[1]。腦出血在我國發(fā)病率約為20%，遠高于歐美國家[2]，發(fā)病后30 d內(nèi)死亡率超過40%[3]，是急性腦血管病中致死率最高的亞型[4]，嚴重危害人類生命健康。除原發(fā)性腦損傷外，腦出血后血腫引發(fā)的顱內(nèi)高壓、腦疝等繼發(fā)性腦損傷，是導致大腦神經(jīng)功能損傷的重要原因[5]。研究發(fā)現(xiàn)，腦組織內(nèi)星形膠質(zhì)細胞的活化、增殖在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用[6]，對星形膠質(zhì)細胞活化機制的深入研究已成為近年來腦卒中等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病靶向治療的重點關(guān)注方向之一[7-8]。EGFR/STAT3 通路被報道參與了腦損傷后星形膠質(zhì)細胞的活化、增殖過程，降低該通路信號轉(zhuǎn)導能夠抑制星形膠質(zhì)細胞活化，進而減輕腦出血后繼發(fā)性腦損傷[9-11]。研究證實，針刺“百會”透“曲鬢”對腦出血急性期受損神經(jīng)細胞有著明顯的保護作用[4,12-13]，但關(guān)于該方法對腦出血后EGFR/STAT3 信號通路的調(diào)控機制尚未見報道。因此，本研究擬采用大鼠自體血注入法復制腦出血模型，誘導星形膠質(zhì)細胞活化，并給予針刺“百會”透“曲鬢”干預(yù)治療，探討該方法對腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷的干預(yù)效果及對EGFR/STAT3通路的影響，現(xiàn)匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性健康SD大鼠，購于黑龍江中醫(yī)藥大學GLP實驗動物中心[許可證號：SCXK(吉)-2019-0004]，8周齡，體質(zhì)量(260±20)g。實驗室環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行造模分組，飼養(yǎng)條件：12 h/12 h晝夜交替循環(huán)，溫度(25±2)℃，濕度50%～60%，每8 h自動通風換氣，自由進食飲水。

1.2 實驗儀器

Lab Standard腦立體定位儀(美國Stoelting公司);FYL-YS-280L實驗室大鼠恒溫箱(FU.YI.LIAN公司);奧林巴斯BX53熒光顯微鏡(OLYMPUS公司);Stuart SHM2勻漿器(Bibby-Stuart公司);SDS-PAGE凝膠電泳儀(美國Bio-rad公司，型號：165-8029);CBIO-GelPro凝膠電泳智能成像系統(tǒng)(北京賽百奧科技有限公司);UV5紫外可見分光光度計(METTLER TOLEDO公司)。

1.3 實驗試劑

TBST溶液，Triton X-100(國藥集團化學試劑有限公司)；山羊血清封閉液，鼠抗GFAP、EGFR抗體，DAB 顯色試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；鼠抗p-JAK1、p-STAT3多克隆抗體，β-actin 抗體(Santa Cruz公司)；Trizol、Rnase試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Sigma-aldrich公司)；SYBR Premis Ex Taq Ⅱ(Perfect Real Time)試劑盒(美國NEB公司)。

1.4 造模與分組

取126只實驗大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=18)、模型組(n=54)和針刺組(n=54)，模型組和針刺組又按照造模后6 h、3 d和7 d 3個時間點分為3個亞組(n=18)。腦出血模型采用大鼠尾狀核自體動脈血注入法復制[9]，將大鼠腹腔注射10 %水合氯醛麻醉，劑量350 mg/kg，俯臥位固定于腦立體定位儀上，調(diào)整至前后囟在同一平面上，取雙眼、雙耳中線交叉處備皮消毒，縱向做一1 cm切口，充分暴露前囟點和冠狀縫，以腦立體定位儀定位注血點(以Bregma點為中心，后側(cè)0.2 mm，右側(cè)3.5 mm處)，以牙科鉆鉆一直徑約1.0 mm的圓孔，深度達硬腦膜。將大鼠尾部自尾端3 cm處剪短，以微量注射器取血50 μL后固定于腦立體定位儀上，沿鉆孔垂直進針約6 mm，以20 μL/min速度緩慢注入大鼠尾狀核內(nèi)，注血后需留針約5 min，再緩慢拔針。以牙科磷酸鋅水門汀封閉鉆孔，縫合頭皮，局部碘伏消毒。待大鼠麻醉蘇醒后，以Bederson評分法為標準，評定為1～3分即為造模成功。假手術(shù)組僅模擬造模手術(shù)過程，不給予自體血注入。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 針刺組 參考《實驗動物穴位圖譜》選取大鼠百會穴、曲鬢穴，將大鼠固定后消毒穴周皮膚，取毫針(0.25 mm×25 mm)針刺百會穴，針尖朝向右側(cè)曲鬢穴透刺，進針約25 mm，留針30 min，期間以200 r /min速度捻針3次，每次2 min。針刺6 h組大鼠在造模蘇醒后即給予1次針刺干預(yù)，針刺3 d、7 d組每日給予1次針刺干預(yù)。

1.5.2 假手術(shù)組、模型組 不作針刺干預(yù)，僅每日在針刺相同時間給予1次抓取固定。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 神經(jīng)行為學評分 采用改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)[14]，對造模后各時間點大鼠的神經(jīng)功能進行評分，總分最高為18分，分值越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴重。

1.6.2 免疫熒光觀察GFAP、EGFR陽性細胞分布 于造模后相應(yīng)時間點(6 h、3 d和7 d)以10 %水合氯醛麻醉大鼠，開胸后充分暴露心臟，左心室插管行0.9 %生理鹽水和4 %多聚甲醛依次心臟灌注，快速斷頭取腦，置于4 %多聚甲醛液中浸泡24 h，做成5 μm厚冰凍腦片備用。切片滴加0.3% Triton X-100室溫通透20 min，PBS漂洗3次×5 min，滴加山羊血清室溫封閉1 h，吸凈封閉液，滴加稀釋好的GFAP、EGFR一抗(1∶100)，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次×5 min，吸凈后滴加稀釋好的熒光二抗(1∶100)，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗3次×5 min，甘油封片后至熒光顯微鏡下觀察。每個樣本在200倍鏡下隨機選取5個視野，使用Image Pro Plus 6.0軟件進行圖像處理，觀察視野內(nèi)GFAP、EGFR陽性細胞計數(shù)。

1.6.3 Western blot檢測p-JAK1和p-STAT3蛋白表達 于造模后相應(yīng)時間點(6 h、3 d和7 d)以10 %水合氯醛麻醉大鼠后快速斷頭取腦，分離血腫周圍腦組織，PBS溶液清洗、剪碎后移至勻漿器中，加4 ℃足量裂解液，勻漿30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉孵育2 h，加入稀釋好的p-JAK1、p-STAT3一抗(1∶1 00)，4 ℃恒溫孵育過夜。TBST漂洗3次×10 min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h，再次洗膜3次×10 min，加入DAB顯色、曝光，采用凝膠電泳智能成像系統(tǒng)掃描、分析實驗結(jié)果，以各目的蛋白與β-actin的光密度比值表示蛋白的相對表達量。

1.6.4 Real-time PCR檢測GFAP、EGFR mRNA水平 采用Trizol法提取腦組織總RNA，加Rnase水適量充分溶解后，紫外分光光度計檢測RNA濃度及OD260/OD280，符合實驗要求。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，由invitrogen公司設(shè)計合成相應(yīng)的引物序列，GFAP正向：5′-TAATGACTATCGCCGCCAACTG-3′，反向 ：5′-TTCGCCCTCCGCAATTTC-3′；EGFR正向：5′-CCTGGTCTGGAAGTACGCAG-3′，反向：5′-CGATGGACGGGATCTTAGGC-3′。使用SYBR Premis Ex Taq Ⅱ(Perfect Real Time)試劑盒進行PCR擴增，反應(yīng)程序：95 ℃,30 s(95 ℃,5 s；60 ℃,30 s；72 ℃,1 s)×40個循環(huán)。以GAPDH水平作為內(nèi)參，以2-△△Ct值表示GFAP、EGFR mRNA的相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 實驗結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)行為學評分比較

與假手術(shù)組比較，不同時間點模型組和針刺組大鼠mNSS評分均顯著升高(P<0.05) ；與模型組比較，相同時間點針刺組大鼠mNSS評分均明顯降低，在第3天、7天時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并隨時間呈明顯下降趨勢。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)行為學評分比較

2.2 各組大鼠GFAP、EGFR陽性細胞分布

免疫熒光觀察各組大鼠7 d時腦組織GFAP、EGFR陽性細胞分布，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組和針刺組大鼠的GFAP、EGFR陽性細胞計數(shù)明顯增多(P<0.05)；與模型組比較，針刺組大鼠的GFAP、EGFR陽性細胞計數(shù)明顯減少(P<0.05)。見圖1、表2。

表2 各組大鼠7 d時GFAP、EGFR陽性細胞計數(shù)個·m-2)

圖1 各組大鼠7 d時GFAP、EGFR陽性細胞分布(200×)

2.3 各組大鼠不同時間點p-JAK1、p-STAT3蛋白表達比較

腦組織p-JAK1、p-STAT3蛋白表達在腦出血后6 h出現(xiàn)明顯增多，并持續(xù)升高，至3 d時達到峰值，7 d時可見下降。與假手術(shù)組比較，不同時間點模型組和針刺組大鼠的p-JAK1、p-STAT3蛋白表達均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，相同時間點針刺組大鼠的p-JAK1、p-STAT3蛋白表達均明顯降低，在第3天、7天時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2和表3～4。

圖2 各組大鼠不同時間點p-JAK1、p-STAT3蛋白表達電泳圖

表3 各組大鼠不同時間點p-JAK1蛋白表達比較

表4 各組大鼠不同時間點p-STAT3蛋白表達比較

2.4 各組大鼠不同時間點GFAP、EGFR mRNA水平比較

腦組織GFAP、EGFR mRNA水平在腦出血后6 h出現(xiàn)明顯增多，并持續(xù)升高，至3 d時達到峰值，7 d時可見下降。與假手術(shù)組比較，不同時間點模型組和針刺組大鼠的GFAP、EGFR mRNA水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，相同時間點針刺組大鼠的GFAP、EGFR mRNA水平均明顯降低，在第3天、7天呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。見表5～6。

表5 各組大鼠不同時間點GFAP mRNA水平比較

表6 各組大鼠不同時間點EGFR mRNA水平比較

3 討論

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最豐富的細胞，對神經(jīng)元結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著支撐作用[15]。在正常生理條件下，星形膠質(zhì)細胞為靜止、活化兩種細胞形態(tài)并存，而在腦出血等病理條件下，靜息狀態(tài)的星形膠質(zhì)細胞可以迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，并分泌多種炎癥細胞因子、細胞毒性因子等，誘導繼發(fā)性腦損傷發(fā)生，阻礙神經(jīng)元再生和神經(jīng)功能恢復[9,16-17]。同時，星形膠質(zhì)細胞過度增生形成的膠質(zhì)瘢痕屏障，可對腦局部微血管產(chǎn)生壓迫，影響局部腦血流供應(yīng)[18]。因此，抑制腦出血后星形膠質(zhì)細胞活化，并對其活化機制及調(diào)控因素進行深入研究，對于改善腦出血后繼發(fā)性腦損傷，促進神經(jīng)功能恢復有著重要的意義。

膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質(zhì)細胞的特異性分子標記物，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后多呈現(xiàn)高表達，以反應(yīng)星型膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)[11,19]。EGFR是一種特殊的跨膜糖蛋白，與自身配體結(jié)合后，可激活胞漿內(nèi)酪氨酸蛋白激酶活性，并激活下游多條信號通路轉(zhuǎn)導，刺激星形膠質(zhì)細胞的分化與增殖[20-21]。已有研究發(fā)現(xiàn)，GFAP、EGFR在腦出血后血腫周圍腦組織中長時間處于高表達狀態(tài)，并主要定位于活化的星形膠質(zhì)細胞中[11,22]，提示，二者可作為上游調(diào)控因子介導星形膠質(zhì)細胞活化的信號轉(zhuǎn)導。JAK/STAT通路是EGFR下游重要的信號傳導通路之一，同時還是IFN、IL-6、ECF、EPO及TNF-α等多種細胞因子的反應(yīng)性通路，各種細胞因子與細胞表面受體結(jié)合后，誘導受體上的酪氨酸殘基磷酸化形成二聚體，使STAT離開受體轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，結(jié)合DNA序列調(diào)控基因表達，從而介導多種病理過程中炎癥、免疫反應(yīng)的發(fā)生[11,23]。Leung YK等[24]研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT通路可在腦損傷過程中被激活，參與調(diào)控并促進星形膠質(zhì)細胞的分化、增殖。此外，由活化星形膠質(zhì)細胞誘導的JAK/STAT信號通路介導的炎癥反應(yīng)，還可進一步加劇神經(jīng)細胞損傷，阻礙神經(jīng)功能恢復。STAT3是STAT蛋白家族成員之一，在GFAP啟動子上有結(jié)合位點，可在激活后與其位點結(jié)合，引發(fā)酪氨酸的快速磷酸化和核轉(zhuǎn)位，從而調(diào)控靶基因表達，誘導星形膠質(zhì)細胞的活化、增生[25]。也有研究顯示，STAT3是EGFR重要的下游效應(yīng)分子，EGFR可通過磷酸化STAT3刺激星形膠質(zhì)細胞活化，誘導神經(jīng)細胞損傷[26]。

基于此，本研究采用針刺“百會”透“曲鬢”干預(yù)腦出血模型大鼠，探討該方法對腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷及EGFR/STAT3通路的影響，為腦出血后干預(yù)星形膠質(zhì)細胞活化提供新的治療依據(jù)。腦出血在中醫(yī)學中歸屬于“大厥”“薄厥”等疾病范疇，具體表現(xiàn)為薄仆而厥、人事不知、半身不遂和肢體不仁等癥，病情進展迅速，癥候錯綜復雜。頭穴透刺作為一種獨特的針刺治療模式，用于治療中風后神經(jīng)功能障礙療效顯著，已得到世界醫(yī)學界的公認。透刺法可通過一針跨多經(jīng)多穴，統(tǒng)調(diào)各經(jīng)穴之間的聯(lián)系，擴大針刺治療范圍，加強針感擴散、傳導，起到分別針刺兩穴所達不到的治療效果。筆者依據(jù)多年的臨床實踐證實，百會透曲鬢為治療出血性腦卒中的較佳刺激區(qū)，百會居顛頂，歸屬督脈，為手足三陽、督脈之會，與腦聯(lián)系密切，是調(diào)節(jié)腦功能的要穴；曲鬢穴位在頭部，歸屬足少陽膽經(jīng)，為足太陽、少陽之會。百會透曲鬢這一穴線橫跨頂、額和營區(qū)，有督脈、足太陽膀胱經(jīng)和足少陽膽經(jīng)多條陽經(jīng)貫穿，固刺激這一穴線具有統(tǒng)調(diào)一身陽氣、醒腦開竅的作用。在前期的實驗研究中業(yè)已證實，針刺“百會”透“曲鬢”治療急性期ICH大鼠，能夠明顯改善大鼠繼發(fā)性腦水腫和神經(jīng)功能缺損癥狀，減輕炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，抑制神經(jīng)細胞凋亡，具有明確的腦保護作用[27-29]。

本研究結(jié)果顯示，百會透曲鬢干預(yù)后，針刺組大鼠在6 h、3 d和7 d時mNSS評分均較模型組降低，在3 d、7 d時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并隨時間呈明顯下降趨勢。免疫熒光顯示，在7 d時針刺組大鼠GFAP、EGFR陽性細胞計數(shù)明顯低于模型組(P<0.05)。Western blot和Real-time PCR結(jié)果可見，模型組、針刺組大鼠腦組織p-JAK1、p-STAT3蛋白表達和GFAP、EGFR mRNA水平均在腦出血后6 h出現(xiàn)明顯增多，并持續(xù)升高，至3 d時達到峰值，7 d時可見下降，其中，針刺組大鼠在第6 h、3天及7天時的上述蛋白表達均較模型組降低，在第3天、7天時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示，百會透曲鬢能夠降低血腫腦組織GFAP、EGFR、p-JAK1及p-STAT3等蛋白表達，并減輕腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷，該治療作用可能是通過調(diào)控EGFR/STAT3通路抑制星形膠質(zhì)細胞活化實現(xiàn)的。

綜上所述，百會透曲鬢可通過調(diào)控EGFR/STAT3通路減輕腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷，在腦出血治療中發(fā)揮腦保護作用。