宋 澤， 余顯權(quán)， 黎小冰， 陳惠查， 阮仁超, 王玲莉， 宋 倫

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所， 貴陽 550006；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽 550025； 3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所， 貴陽 550006;4.安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 貴州 安順 561000)

稻瘟病是世界范圍內(nèi)危害水稻生產(chǎn)最嚴(yán)重的真菌性病害之一，可發(fā)生在任何稻作區(qū)，在高溫高濕雨季較長(zhǎng)的區(qū)域，極易大面積爆發(fā)，如不及時(shí)進(jìn)行有效防治，會(huì)導(dǎo)致水稻產(chǎn)量大幅度降低甚至絕收[1]。傳統(tǒng)防治方法是利用化學(xué)藥劑控制其發(fā)生，而化學(xué)藥劑防治不僅使生產(chǎn)成本增加，而且藥劑殘留也會(huì)對(duì)人畜和環(huán)境造成不同程度毒害和污染[2]。培育抗性品種成為控制病害最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑，但傳統(tǒng)的抗病育種依靠表型來進(jìn)行選擇，易受外界環(huán)境條件影響而選擇效率不高，且育種周期較長(zhǎng)[3]。由于稻瘟病菌生理小種遺傳較為復(fù)雜，抗病品種在推廣種植數(shù)年內(nèi)就逐漸喪失抗性。育種實(shí)踐證明，以獲得的抗性基因能夠培育出對(duì)稻瘟病具有持久抗性的水稻新品種。利用分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)選擇個(gè)體進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域及全基因組的篩選，能夠快速提高抗病基因的轉(zhuǎn)育選擇，加快進(jìn)程、提高效率，已被廣泛應(yīng)用于水稻育種實(shí)踐[4-7]。

“大粒溪香”是貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院以貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所創(chuàng)制的水稻特異種質(zhì)“大粒香”為親本材料，以改良其抗病性和產(chǎn)量為育種目標(biāo)所培育出的品質(zhì)好、產(chǎn)量高、香味濃的水稻新品系，其綜合抗病性較“大粒香”得到一定程度的提升，更顯現(xiàn)出葉瘟抗性增強(qiáng)，而對(duì)穗頸瘟的抗性改良效果不突出。為此，本研究利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，以攜帶Pi1和Pi9抗病基因且農(nóng)藝性狀表現(xiàn)與大粒溪香相近的BC4F2群體為材料，通過異地加代完成了BC5F5株系的構(gòu)建，并對(duì)其進(jìn)行苗瘟接種鑒定及不同生態(tài)環(huán)境的田間自然鑒定，全面評(píng)價(jià)大粒溪香改良株系在不同生態(tài)區(qū)的抗性水平，以期創(chuàng)制出保持大粒溪香優(yōu)良特性的新品系，為水稻優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病育種和種質(zhì)創(chuàng)新利用提供實(shí)踐參考和新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以大粒溪香為感病受體親本(感病對(duì)照)、金23 B為抗病供體親本，獲得攜帶Pi1和Pi9抗病基因的BC4F2群體為基礎(chǔ)材料，并通過加代構(gòu)建BC5F5株系，均由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

用于接種的稻瘟病菌株系貴州省主要稻區(qū)征集而來，包含了ZA～ZG 5群的11個(gè)單孢分離菌株(08-108-1，08-48-2，08-234-2，08-232-2，08-100-1，08-41-1，08-229-1，08-31-2，07-46-1，07-99-1，07-52-1)，由貴州省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所提供。

1.2 分子標(biāo)記選擇

本研究利用已報(bào)道與抗性基因Pi1緊密連鎖的SSR標(biāo)記RM 224(F：5′-ATCGATCGATCTTCACG

AGG-3′；R：5′-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3′)，根據(jù)抗性基因Pi9的內(nèi)部堿基序列開發(fā)的STS標(biāo)記pB 8(F：5′-CCGGACTAAGTACTGGCTTCGATA-3′；R：5′-CCCAATCTCCAATGACCCATAAC-3′)，對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 DNA提取和PCR反應(yīng)

采用CTAB法提取水稻DNA。PCR反應(yīng)體系總體積10 μL：模板DNA(30～50 ng/μL)2 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)1.2 μL，dNTP 0.2 μL，5 U/μLTaq酶0.1 μL，正、反向引物各1 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，銀染后記錄結(jié)果。

1.4 稻瘟病抗性鑒定

1.4.1苗期接種鑒定

于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。將供鑒材料播種于育秧盤(54 cm×28 cm)中，每穴15～20苗，設(shè)2個(gè)重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組排列。偏施氮肥，待幼苗生長(zhǎng)至3～4葉，高壓噴霧接種稻瘟病菌混合孢子懸浮液。接種后溫室內(nèi)25 ℃遮陰保濕24 h，高濕培養(yǎng)7～10 d，創(chuàng)造有利的發(fā)病條件，充分發(fā)病后參照貴州省地方標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查苗瘟感病情況。

1.4.2田間自然鑒定

選擇貴州省稻瘟病常年高發(fā)病區(qū)的湄潭縣抄樂鎮(zhèn)和黎平縣黎平寨進(jìn)行葉瘟、穗瘟抗性鑒定。2020年分別播種大粒溪香及改良株系。適時(shí)移栽，株行距16.7 cm×20 cm，單本種植，每個(gè)材料栽6行，每行10株，2個(gè)重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組排列，供鑒材料兩邊種植高感稻瘟病品種大粒溪香。田間管理措施參照當(dāng)?shù)厣a(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，偏施氮肥，并多次追肥，全生育期保持田間水分充足，未用殺菌劑，水稻分蘗期和成熟后分別進(jìn)行葉瘟和穗瘟調(diào)查，鑒定標(biāo)準(zhǔn)同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記輔助選擇及株系的篩選

利用雙聚合材料金23 B與大粒溪香雜交構(gòu)建的BC4F2群體，2018年在貴州湄潭抗性鑒定圃回交，然后分別于海南三亞和貴州錦屏自交加代至BC5F5，通過分子標(biāo)記輔助選擇篩選，獲得83個(gè)含抗性基因的株系(圖1)。其中含有Pi1基因株系17個(gè)、Pi9基因23個(gè)、雙基因型株系43個(gè)(表1)。

注：Mark為DNA Mark B(100～600 bp)，P1為輪回親本大粒溪香，P2為聚合材料。 圖1 改良株系的篩選 Fig.1 Screening of improved lines

表1 篩選獲得不同基因型株系Table 1 Different genotype lines screened in this study

2.2 稻瘟病抗性鑒定

2.2.1改良株系苗瘟抗性接種鑒定

為了評(píng)價(jià)改良不同基因型株系的苗瘟抗性水平，選用貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所提供含ZA-ZG 5個(gè)種群的11個(gè)菌株混合孢子懸浮液對(duì)其進(jìn)行苗瘟抗性鑒定。結(jié)果表明，感病對(duì)照大粒溪香苗瘟病級(jí)為7級(jí)感病。改良株系的病級(jí)在2～6級(jí)之間，在含有Pi1基因的株系中，病級(jí)為2級(jí)的只有1個(gè)株系QHX 183，病級(jí)表現(xiàn)為2～4級(jí)的有11個(gè)株系，占該基因型的70.6%；在Pi9基因株系中，病級(jí)為2級(jí)的有2個(gè)株系，表現(xiàn)為2～4級(jí)的有20個(gè)株系，占該基因型的87.0%；同時(shí)含有Pi1和Pi9抗性基因的株系中，病級(jí)為2級(jí)的有1個(gè)株系，病級(jí)表現(xiàn)為2～4級(jí)的有35個(gè)株系，占該基因型的81.4%。改良株系中病級(jí)為2～4級(jí)，表現(xiàn)為抗、中抗和中感的共有67個(gè)株系，占80.7%。表明經(jīng)過分子標(biāo)記輔助選擇的83個(gè)株系相較感病的大粒溪香，其苗瘟抗性水平均有不同程度的提升。

2.2.2改良株系的田間抗性鑒定

2020年將上述83個(gè)株系分別于湄潭縣抄樂鎮(zhèn)和黎平縣黎平寨進(jìn)行稻瘟病田間抗性鑒定，結(jié)果見圖2和表2。

表2 不同基因型改良株系抗性分布頻率Table 2 Resistance distribution frequency of different genetically modified lines

圖2 改良株系抗病級(jí)別分布Fig.2 Distribution of disease resistance grades of improved lines

在湄潭鑒定圃有55個(gè)株系綜合抗性指數(shù)表現(xiàn)為3級(jí)(中抗，下同)，占65.1%。在含有Pi1基因的17個(gè)株系中，抗病3級(jí)的有11個(gè)株系，5級(jí)(中感)的有6個(gè)株系，分別占64.7%和35.3%；含Pi9基因的23個(gè)株系中有15個(gè)株系表現(xiàn)為3級(jí)，占65.2%；含有雙基因的43個(gè)株系中有29個(gè)達(dá)到3級(jí)，占67.4%。結(jié)果表明，與其原始親本大粒溪香相比，改良株系的稻瘟病抗性得到有效增強(qiáng)，其中78個(gè)株系對(duì)稻瘟病具有顯著的抗性。

在黎平鑒定圃65個(gè)株系綜合抗性指數(shù)表現(xiàn)為1～3級(jí)抗病，占78.3%；表現(xiàn)為5級(jí)(中感)的有16個(gè)株系，占19.3%；表現(xiàn)為7級(jí)(感病)的只有2個(gè)株系，占2.4%。在含有Pi1基因的17個(gè)株系中抗病表現(xiàn)為3級(jí)的有12個(gè)株系，占70.6%；含Pi9基因的23個(gè)株系中有21個(gè)表現(xiàn)為3級(jí)，占91.3%；含有雙基因的43個(gè)株系中有3個(gè)株系達(dá)1級(jí)、29個(gè)株系為3級(jí)，分別占7.0%和67.4%。綜上表明，攜帶不同抗性基因株系在不同鑒定圃的抗性水平不同，可能緣于不同鑒定圃稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)差異，尤其是其優(yōu)勢(shì)生理小種的致病力也不相同所致。

2.2.3不同基因型改良株系兩鑒定點(diǎn)平均抗病性評(píng)價(jià)

親本大粒溪香在湄潭和黎平病圃鑒定時(shí)發(fā)病較重，葉瘟病級(jí)為8級(jí)和7級(jí)，穗瘟均為9級(jí)高感，其綜合抗性指數(shù)為8.4，表現(xiàn)為高感稻瘟病。含有抗性基因株系的抗性較對(duì)照親本大粒溪香有了大幅度的提高，改良株系葉瘟病級(jí)為1～7級(jí)；穗瘟大部分在5～9級(jí)，雖然表現(xiàn)為感病，但其穗瘟損失率較低，相較對(duì)照大粒溪香的8級(jí)穗瘟損失率，降低了3～7個(gè)病級(jí)。結(jié)果表明，含有抗性基因株系的抗性較對(duì)照親本有了明顯的提高(圖3)。其中有53個(gè)改良株系的綜合抗性指數(shù)為2.48～4.08，表現(xiàn)為中抗稻瘟病；29個(gè)株系綜合抗性指數(shù)為4.10～6.04，綜合評(píng)價(jià)為中抗到中感之間，獲得一批可供育種利用的抗病新種質(zhì)。

圖3 大粒溪香及改良株系田間葉瘟及穗瘟感病情況Fig.3 Field leaf blast and ear blast susceptibility of Dalixixiang and improved lines

3 討論與結(jié)論

分子標(biāo)記輔助選擇是利用分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的特點(diǎn)，進(jìn)而檢測(cè)目標(biāo)基因是否存在的技術(shù)，具有較高的選擇效率、選擇結(jié)果可靠、不易受環(huán)境條件干擾等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。防治水稻病害最經(jīng)濟(jì)有效的途徑是培育抗性品種，既減少生產(chǎn)成本又能降低對(duì)環(huán)境的污染[10]。李瑤等[11]和Wani等[12]利用分子標(biāo)記輔助選擇在水稻抗病育種方面已取得較大的研究進(jìn)展。Korachan等[13]通過標(biāo)記輔助回交(MAB)利用組合的抗稻瘟病QTL(qBl 1，2，11，12)和Saltol QTL進(jìn)行基因聚合，在BC4F4中篩選出高抗稻瘟病和鹽脅迫單株。本研究利用與抗稻瘟病基因Pi1、Pi9緊密連鎖的SSR和STS分子標(biāo)記RM 224、pB 8，對(duì)大粒溪香和聚合雙基因的金23 B回交后代進(jìn)行選擇，篩選出具有目標(biāo)基因的后代。在BC5F5共獲得83個(gè)不同基因型的株系，其中Pi1基因有17個(gè)株系、Pi9基因有23個(gè)株系、雙基因型有43個(gè)株系。

因稻瘟病菌有著變異性強(qiáng)、分布范圍廣和致病性高度分化等特點(diǎn)，具有單個(gè)抗性基因的改良水稻只對(duì)少數(shù)病菌有效，而且攜帶單個(gè)抗性基因的品種一般推廣后不久開始面臨抗性喪失，無法在生產(chǎn)上繼續(xù)利用[14]。所以選擇兩個(gè)或多個(gè)廣譜抗性基因進(jìn)行聚合育種是非常有必要的。張菊萍等[15]通過MAS技術(shù)將Pi1和Pi49兩個(gè)抗稻瘟病基因?qū)雰上挡挥祫?chuàng)5 S中，明顯提高改良后不育系的抗性，可用來配制抗稻瘟病兩系雜交稻組合。本研究中所采用的Pi1和Pi9基因已被大部分研究證實(shí)，屬于廣譜的抗病基因，本課題組前期對(duì)攜帶稻瘟病抗性基因Pi1、Pi9雙基因聚合材料，進(jìn)行了稻瘟病抗性鑒定，結(jié)果表明，基因聚合后抗性較大粒溪香有了大幅度的提升，達(dá)到中抗水平[10]，這與本研究結(jié)果基本一致，表明Pi1和Pi9在株系中能夠穩(wěn)定遺傳，具有很高的利用價(jià)值。而李耀棟[16]對(duì)寧夏582個(gè)水稻雜交后代稻瘟病抗性基因進(jìn)行分子檢測(cè)，最后結(jié)合抗病性、抗稻瘟病基因型和農(nóng)藝性狀綜合分析表明，并不是基因數(shù)量越多抗性越好，而是不同基因間表現(xiàn)出復(fù)雜的互作效應(yīng)。結(jié)合此次鑒定結(jié)果可以看出，Pi1、Pi9單基因株系和雙聚合株系雖然在苗瘟、葉瘟和穗瘟抗病能力強(qiáng)于對(duì)照大粒溪香，但三者間綜合抗性指數(shù)并無明顯差異，而且部分單基因的株系抗性甚至優(yōu)于聚合株系，可能由于人為選擇導(dǎo)致遺傳背景存在差異。

生產(chǎn)實(shí)踐證明，田間抗性鑒定會(huì)因當(dāng)年的氣候條件和稻瘟病種群結(jié)構(gòu)改變而發(fā)生變化。因此，為做出客觀全面評(píng)價(jià)，應(yīng)進(jìn)行多年多點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性[17-18]。本次試驗(yàn)采用一年兩點(diǎn)田間鑒定和室內(nèi)接種鑒定相結(jié)合，大粒溪香均表現(xiàn)為感稻瘟病，此次鑒定結(jié)果具有一定的可靠性，但不足之處在于室內(nèi)鑒定采用的是混合孢子懸浮液進(jìn)行接種，尚不確定改良株系對(duì)不同生理小種的抗性水平，擬在后續(xù)研究中明確其抗譜。