廖慧琦，曹少謙，楊 華，戚向陽

（浙江萬里學(xué)院，浙江寧波 315100）

鮐魚，又名青占魚，鱸形目，鯖科，鮐屬，其具有分布廣、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，是北太平洋西部主要的經(jīng)濟(jì)魚類之一，調(diào)查研究顯示目前鮐魚主要仍以鮮食為主，僅有少量用于魚粉加工，其深加工產(chǎn)品與產(chǎn)量相比存在巨大差異[1-3]。

近年來對海洋生物中生物活性物質(zhì)的研究成為熱點(diǎn)，其中便包括獲得具有不同生理功能的生物活性肽，如抗氧化肽、ACE 抑制肽、免疫活性肽等。海洋魚類營養(yǎng)價(jià)值高，蛋白質(zhì)含量豐富，一直以來都被視為優(yōu)質(zhì)蛋白來源，因此從海洋魚類蛋白中提取生物活性肽值得更加深入的研究[4-7]。其中免疫活性肽作為一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的生物活性肽，有分子量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、生物活性高等諸多優(yōu)點(diǎn)[8]，同時(shí)根據(jù)已有研究證明免疫活性肽具有能刺激淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬等多種生理功能，目前已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究與保健食品開發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[9-11]。紀(jì)麗娜[12]通過酶解金槍魚頭提取得到的免疫活性肽能刺激巨噬細(xì)胞增殖和促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。侯虎[13]選用胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚獲得的免疫活性肽能提高小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性以及巨噬細(xì)胞的吞噬功能，后利用離子交換色譜、凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜進(jìn)一步純化活性最高的肽組分，進(jìn)而得到3 種免疫活性肽序列。鄧志程[14]采用模擬消化酶解的方式制備馬氏珠母貝全臟器免疫活性肽，同時(shí)結(jié)合超濾、凝膠過濾色譜等技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，獲得了兩個(gè)免疫活性肽。同時(shí)也有一些研究證明通過酶解制備的生物活性肽顯示出特定的免疫活性[15-17]。王雪芹[18]通過酶法制備的鮐魚多肽具有較強(qiáng)的抗氧化性和抗疲勞作用，但是目前將鮐魚作為蛋白質(zhì)來源制備免疫活性肽的研究未見報(bào)道。

本文以鮐魚魚肉為原料，以水解度和小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率為指標(biāo)，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化鮐魚免疫活性肽的酶法制備工藝，以期為酶法制備鮐魚免疫活性肽及進(jìn)一步研究其免疫活性提供依據(jù)，也希望能對后續(xù)免疫活性肽的深入研究以及提高海洋低值魚的利用率提供一些理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鮐魚 購于寧波市路林市場；小鼠脾淋巴細(xì)胞 購于上海賽百慷生物科技有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室復(fù)蘇培養(yǎng)；胰蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT） 索萊寶生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、三氯乙酸、二甲亞砜（DMSO） 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胎牛血清、RPMI-1640 完全培養(yǎng)基 美國Gibco公司。

組織攪碎機(jī) 山東九陽公司；AR223CN 電子天平 常州奧豪斯儀器有限公司；DKS-24 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市偉嘉儀器制造有限公司；超低溫高速離心機(jī) 日本日立公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；PHS-29A 數(shù)顯酸度計(jì) 上海虹益儀器有限公司；超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo 公司；酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad 公司；LCJ-25C 型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 鮐魚去頭去尾，去除內(nèi)臟，剝除魚皮，剔去魚刺，取純?nèi)鈹囁椋糜?40 ℃冰箱冷凍備用。

1.2.2 鮐魚魚肉基本成分的測定 鮐魚魚肉中水分含量測定采用GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》直接干燥法[19]；灰分含量測定采用GB 5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》高溫灰化法[20]；蛋白質(zhì)含量測定采用GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法[21]；脂肪含量的測定采用GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》中的索氏提取法[22]。

1.2.3 蛋白酶的篩選 參考胡旭陽[23]的方法，取一定量的鮐魚魚肉，以料液比1:5 g/mL 加入相應(yīng)pH 緩沖溶液，酶添加量為6000 U/g，在每種蛋白酶的最適條件下酶解6 h。其中木瓜蛋白酶的酶解條件為50 ℃，pH7.0；胰蛋白酶的酶解條件為40 ℃，pH7.0；中性蛋白酶酶解條件為50 ℃，pH7.0；堿性蛋白酶酶解條件為50 ℃，pH10.0；酸性蛋白酶酶解條件為50 ℃，pH3.0。酶解完成后在沸水浴中滅酶15 min，立即冷卻至室溫，于10000 r/min 離心15 min，取上清液。將上清液進(jìn)行真空冷凍干燥，配制成相應(yīng)濃度的樣液，采用MTT 法測定酶解產(chǎn)物對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，篩選最適蛋白酶。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 不同酶添加量對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響 將酶添加量分別設(shè)為2000、4000、6000、8000、10000 U/g，按料液比1:5 g/mL、pH7.0、溫度50 ℃，時(shí)間6 h 進(jìn)行酶解，測定酶解產(chǎn)物的水解度，并采用MTT 法測定小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率。

1.2.4.2 不同酶解時(shí)間對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響 將酶解時(shí)間分別設(shè)為4、5、6、7、8 h，按料液比1:5 g/mL、pH7.0、溫度50 ℃、酶添加量6000 U/g進(jìn)行酶解，測定酶解產(chǎn)物的水解度，并采用MTT 法測定小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率。

1.2.4.3 不同酶解溫度對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響 將酶解溫度分別設(shè)為30、40、50、60、70 ℃，按料液比1:5 g/mL、pH7.0、酶添加量6000 U/g，時(shí)間6 h 進(jìn)行酶解，測定酶解產(chǎn)物的水解度，并采用MTT 法測定小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下，以小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率為指標(biāo)，選擇酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度為工藝參數(shù)，設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化鮐魚魚肉免疫活性肽的最佳酶解工藝，試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factor and levels of response surface experiment

1.2.6 水解度測定 水解度根據(jù)式（1）計(jì)算。其中氨基酸態(tài)氮含量采用GB 5009.235-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的酸度計(jì)法測定[24]；總氮含量采用GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法測定[21]。

1.2.7 小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率測定

1.2.7.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞復(fù)蘇 參考董曉澤[25]的方法并略做修改，從-80 ℃冰箱中將小鼠脾淋巴細(xì)胞凍存管取出，立刻置于37 ℃中水浴融解，在超凈工作臺內(nèi)將解凍的細(xì)胞液全部轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，1000 r/min 離心5 min，棄去上清液，再加入1 mL 配制好的含有10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，輕輕吹打使之均勻分散。將細(xì)胞懸液完全移入T25 的無菌培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)加入4 mL 含有10%胎牛血清的RPMI-1640 完全營養(yǎng)液，輕輕搖動(dòng)瓶身，使其均勻分布在培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。

1.2.7.2 鮐魚魚肉酶解產(chǎn)物對小鼠脾淋巴細(xì)胞的影響 參考李志永[26]的方法以MTT 法測定小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率并略做修改，選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106個(gè)/mL。無菌操作條件下，向96 孔板中依次接種100 μL 細(xì)胞懸液和100 μL 樣液（濃度為500 μg/mL，取凍干后的樣品粉末以RPMI-1640 完全培養(yǎng)基溶解，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌），以等體積RPMI-1640 完全培養(yǎng)基代替樣品作空白對照組，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，并在96 孔板最外圈每孔加入200 μL 無菌PBS 溶液。于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，在避光條件下每孔加入20 μL MTT 溶液（濃度為5 mg/mL，以PBS 溶解，0.22 μm 濾膜過濾除菌），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4000 r/min離心5 min，棄去上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩5 min，立即用酶標(biāo)儀于593 nm 處測定OD 值，根據(jù)式（2）計(jì)算小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率。

式中：A1表示實(shí)驗(yàn)組在593 nm 處的OD 值；A0表示空白組在593 nm 處的OD 值。

1.2.8 氨基酸含量測定 采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的條件制備鮐魚免疫活性肽，樣品經(jīng)真空冷凍干燥，保存于-40 ℃冰箱。根據(jù)GB 5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》[27]的方法，測定分析樣品中的氨基酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品均平行3 組。采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖，Design Expert 10.0 進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮐魚魚肉基本成分分析

鮐魚魚肉基本營養(yǎng)組成成分如表2所示，可以看出鮐魚魚肉中基本營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，其中蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量較低，適用于后續(xù)進(jìn)行酶解制備免疫活性肽的研究。

表2 鮐魚魚肉營養(yǎng)成分組成Table 2 Nutrient composition of chub mackerel meat

2.2 最適蛋白酶的篩選

選擇合適的蛋白酶酶解是提取生物活性肽至關(guān)重要的因素，因?yàn)椴煌牡鞍酌妇哂胁煌拿盖形稽c(diǎn)，從而可以影響肽段從蛋白中的釋放位點(diǎn)[11]。5 種蛋白酶對鮐魚魚肉水解度及酶解產(chǎn)物對小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率的影響如圖1所示，由圖1 可以看出水解度和細(xì)胞相對增殖率的變化趨勢具有明顯差異。從水解度來看，胰蛋白酶的水解度最高，酸性蛋白酶次之，然而這兩種蛋白酶的酶解產(chǎn)物的細(xì)胞相對增殖率較低，中性蛋白酶的水解度雖然偏低，但是具有最高的細(xì)胞相對增殖率，達(dá)31.36%，顯著高于其他蛋白酶的酶解產(chǎn)物（P＜0.05）。因?yàn)榈鞍酌傅姆N類不同，所獲得的酶解產(chǎn)物中的多肽組成也會(huì)不同，因此其具有的生物活性也存在較大差異。其中中性蛋白酶可以對C 端為芳香族疏水性氨基酸的肽鏈進(jìn)行酶切作用[28]，同時(shí)已有大量研究發(fā)現(xiàn)免疫活性肽大多含有疏水性氨基酸，故選擇中性蛋白酶為本實(shí)驗(yàn)中制備鮐魚免疫活性肽的最適蛋白酶。

圖1 不同蛋白酶對鮐魚魚肉水解度及酶解產(chǎn)物對小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率的影響Fig.1 Effects of different proteases on the degree of hydrolysis of mackerel and the relative proliferation rate of spleen lymphocytes in mice

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 酶添加量對水解度和小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率的影響 圖2所示為酶添加量對鮐魚魚肉水解度及酶解產(chǎn)物對小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率的影響。酶添加量由2000 U/g 增加到8000 U/g 時(shí)，水解度和細(xì)胞相對增殖率持續(xù)升高，在酶添加量達(dá)到8000 U/g 時(shí)，相對增殖率達(dá)到最高為43.32%，水解度為48.88%。這說明酶添加量的增加可以提高底物與酶的作用，從而加速酶解反應(yīng)。當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，可能因?yàn)榈孜镆呀?jīng)充分酶解，酶的作用位點(diǎn)減少，水解度和小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率不再隨著添加量的增多而升高，反而有所下降，這說明適當(dāng)?shù)牡鞍酌柑砑恿?，可使酶解產(chǎn)物具有更好的生物活性。酶添加量為8000 U/g 時(shí)，酶解產(chǎn)物的水解度和細(xì)胞相對增殖率顯著（P＜0.05）高于其他組分，故確定中性蛋白酶的最適酶添加量為8000 U/g。

2.3.2 酶解時(shí)間對水解度和小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率的影響 圖3所示為酶解時(shí)間對鮐魚魚肉水解度及酶解產(chǎn)物對小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率的影響。時(shí)間從4 h 升至7 h 時(shí)，水解度和細(xì)胞相對增殖率持續(xù)升高，酶解時(shí)間為7 h 時(shí)，細(xì)胞相對增殖率達(dá)到最高為44.92%，水解度為49.17%。當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長至8 h 時(shí)，細(xì)胞相對增殖率開始降低，但是水解度與7 h 相差不大，這可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間的延長，蛋白酶活力逐漸下降，故水解度的變化趨勢逐漸平緩，但是酶解反應(yīng)仍在進(jìn)行，其中一些具有免疫活性的肽鏈可能會(huì)失去活性，導(dǎo)致細(xì)胞相對增殖率降低。故確定中性蛋白酶的最適酶解時(shí)間為7 h。

2.3.3 酶解溫度對水解度和小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率的影響 圖4所示為酶解溫度對鮐魚魚肉水解度及酶解產(chǎn)物對小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率的影響。由圖4 可以看出，隨著溫度的升高，水解度隨之變化，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，水解度達(dá)49.75%，顯著高于其他溫度下的酶解產(chǎn)物（P＜0.05）。當(dāng)溫度由30 ℃升高至40 ℃時(shí)，細(xì)胞相對增殖率升高，50 ℃時(shí)，細(xì)胞相對增殖率最高，達(dá)31.96%。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，細(xì)胞相對增殖率呈下降趨勢。這可能是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，隨著溫度的升高，蛋白酶活力會(huì)增大，有利于酶解反應(yīng)產(chǎn)生具有免疫活性的肽段[29]。當(dāng)溫度升高至70 ℃時(shí)，其水解度和細(xì)胞相對增殖率相比50 ℃時(shí)明顯降低，但是可以看出70 ℃時(shí)水解度依然較高，但是細(xì)胞相對增殖率偏低，猜測可能是因?yàn)?0 ℃時(shí)酶解反應(yīng)仍在進(jìn)行，但長時(shí)間在較高溫度下進(jìn)行反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致蛋白變性，使酶解產(chǎn)生的肽段失去生物活性。同時(shí)根據(jù)索萊寶公司提供的產(chǎn)品信息顯示，該中性蛋白酶的最適溫度為50～55 ℃，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果也較為符合。故確定中性蛋白酶的最適酶解溫度為50 ℃。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化工藝

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken 的組合設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert10.0 軟件設(shè)計(jì)3 因素3 水平共17 組實(shí)驗(yàn)，其中中心點(diǎn)重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)，以小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率作為響應(yīng)值，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，建立制備工藝參數(shù)回歸模型，擬合得到細(xì)胞相對增殖率（Y）和酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、酶添加量（C）的回歸方程為：Y=41.76+1.25A+2.86B+8.578C-1.01AB+0.42AC+1.58BC-1.78A2-5.94B2-5.58C2。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Respond surface experimental design and results

回歸系數(shù)的顯著性分析結(jié)果見表4，結(jié)果顯示，模型的F值為9.73，P值為0.0033＜0.05，表明該回歸模型顯著。失擬項(xiàng)的P值為0.1029，失擬項(xiàng)不顯著，說明試驗(yàn)沒有失擬因素，可以充分反映試驗(yàn)的實(shí)際情況，因此可以確定該回歸模型可以對鮐魚魚肉中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率結(jié)果進(jìn)行預(yù)測和分析。由表4可知，對結(jié)果影響的主次順序?yàn)槊柑砑恿浚久附鉁囟龋久附鈺r(shí)間，其中酶添加量對結(jié)果的影響極顯著。

表4 回歸模型方差分析Table 4 ANOVA of regression equation

2.4.2 響應(yīng)曲面分析交互作用 模型的響應(yīng)曲面如圖5所示，3 組圖直觀反映了3 個(gè)因素間的兩兩交互作用。由圖5a 曲面的彎曲程度和等高線的封閉情況可以看出，當(dāng)酶添加量固定不變時(shí)，酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用明顯，當(dāng)酶解時(shí)間改變時(shí)，酶解溫度對細(xì)胞相對增殖率的影響表現(xiàn)出不同程度的變化；當(dāng)酶解溫度改變時(shí)，酶解時(shí)間對細(xì)胞相對增殖率的影響也表現(xiàn)出不同程度的變化。當(dāng)酶解溫度固定時(shí)，酶添加量與酶解時(shí)間對細(xì)胞相對增殖率的交互作用如圖5b所示，可以看出酶添加量對細(xì)胞相對增殖的影響高于酶解時(shí)間，隨著酶解時(shí)間的變化，細(xì)胞相對增殖率變化趨勢不明顯。由圖5c 可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間固定時(shí)，酶添加量與酶解溫度對細(xì)胞增殖率的交互作用明顯，其中酶添加量對細(xì)胞增殖率的影響高于酶解溫度。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plots and corresponding contour plots showing the interaction effects of various parameters

通過上述模型對鮐魚魚肉免疫活性肽的酶解工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，軟件分析得到的最佳工藝條件為酶解時(shí)間7.18 h，酶解溫度51.6 ℃、酶添加量8827 U/g，預(yù)測的細(xì)胞相對增殖率為45.99%。考慮到實(shí)際操作情況，對上述優(yōu)化條件進(jìn)行修正，最終確定優(yōu)化條件為酶解時(shí)間7 h、酶解溫度52 ℃、酶添加量8800 U/g，在此條件下測得細(xì)胞相對增殖率為48.11%±2.67%，所得實(shí)際值與模型預(yù)測值接近，證明應(yīng)用該模型優(yōu)化提取鮐魚魚肉免疫活性肽是準(zhǔn)確可行的。

2.5 氨基酸組成分析

鮐魚免疫活性肽的氨基酸組成如表5所示。由表可知，鮐魚免疫活性肽檢測的16 種氨基酸中谷氨酸含量最高，天冬氨酸次之，同時(shí)賴氨酸、亮氨酸、組氨酸、丙氨酸的含量也較高，其中人體必需氨基酸含量占總氨基酸的45.52%。目前已有研究表明天冬氨酸和谷氨酸在粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中起著多種作用，可為免疫細(xì)胞供能。亮氨酸能增強(qiáng)免疫細(xì)胞殺傷活力，增加對致病因子的清除能力[30]。同時(shí)也有眾多研究表明生物活性肽的免疫活性與其所含的疏水性氨基酸有著密不可分的關(guān)系，當(dāng)肽鏈含有較多疏水性氨基酸時(shí)，多肽表面具有較強(qiáng)的疏水性作用，可增強(qiáng)多肽對自由基的親和力，使多肽的抗氧化能力有所提升，進(jìn)而增強(qiáng)免疫活性[31]。王凱凱[32]對綠豆免疫活性肽的氨基酸序列進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)其中疏水性氨基酸對綠豆肽的免疫活性起著重要作用。張亞飛[33]研究發(fā)現(xiàn)小麥蛋白具有免疫活性的肽段中疏水性氨基酸占有較大的比例。楊磊[34]對螺旋藻免疫活性肽進(jìn)行氨基酸組成分析，結(jié)果顯示其中疏水性氨基酸含量為23.66%。從表5 數(shù)據(jù)可以看出鮐魚免疫活性肽中的疏水性氨基酸含量占總氨基酸的32.00%，相比已有的一些研究結(jié)果，鮐魚免疫活性肽的疏水性氨基酸含量更加豐富。

表5 鮐魚免疫活性肽的氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of immunoactive peptides from chub mackerel

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過酶法制備鮐魚免疫活性肽，確定提取鮐魚免疫活性肽的最佳蛋白酶為中性蛋白酶，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率為評價(jià)指標(biāo)，利用Design-Expert 10.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，結(jié)果表明利用中性蛋白酶制備鮐魚免疫活性肽的最優(yōu)酶解條件為酶解時(shí)間7 h、酶解溫度52 ℃、酶添加量8800 U/g，進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，該條件下測得小鼠脾淋巴細(xì)胞相對增殖率達(dá)48.11%±2.67%，最后對得到的鮐魚免疫活性肽進(jìn)行氨基酸組成分析，結(jié)果顯示其氨基酸含量豐富，其中人體必需氨基酸達(dá)45.52%，疏水性氨基酸含量為32.00%。

隨著對免疫活性肽的研究越來越深入，發(fā)現(xiàn)采用酶解法制備免疫活性肽是安全有效的，但是同時(shí)也存在著許多難題，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)經(jīng)過酶解之后的組成成分十分復(fù)雜，酶解產(chǎn)物中含有大量不同分子量的肽段和游離氨基酸，因此后續(xù)仍需選擇合適的方法進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后期進(jìn)一步分離純化得到鮐魚免疫活性肽奠定基礎(chǔ)，以期為鮐魚的高值化利用及免疫活性肽保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。