王芬， 潘發(fā)蓮， 楊秀， 韋永歡， 裴會敏

黔南民族師范學院生物科學與農(nóng)學院，貴州 都勻 558000

蛋白質(zhì)相互作用是指互相物理接觸或者在功 能上有關的蛋白質(zhì)通過復雜多樣的相互作用連接形成網(wǎng)絡。蛋白質(zhì)相互作用是探索生物學功能的基礎，研究蛋白質(zhì)相互作用對理解和分析茶樹生物功能有著極其重要的意義。蛋白質(zhì)相互作用在蛋白功能預測、疾病的研究和預防、藥物候選研究等方面已得到廣泛應用［1-3］。已有研究基于基因表達譜和核心連接方法從蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中識別蛋白質(zhì)復合物，研究結果在幫助了解細胞過程機制方面具有重要的生物學意義［4］。劉家俊等［5］通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡挖掘出了7個可能與小麥赤霉病抗性相關的蛋白，這些蛋白可能在響應赤霉病中具有重要作用。Seong等［6］利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析了松仁油的脂肪調(diào)控機制，結果表明給小鼠口服松仁油可降低組織中的脂肪含量。崔紅梅［7］發(fā)現(xiàn)，研究在表觀遺傳修飾領域環(huán)境應答基因孕烷受體參與的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，有助于開展環(huán)境應答基因孕烷受體在細胞應激反應領域功能的探索。Adhami等［8］通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的方法重新篩選新冠病毒的治療候選藥物，發(fā)現(xiàn)CARBOPLATIN、CRIZOTINIB和CYTARABINE藥物是潛在的新型冠狀病毒肺炎治療藥物。

茶樹適應于降雨量多、濕度大和溫度適中的地帶，具有適應性廣、綜合性狀優(yōu)良的特性［9-10］。都勻毛尖茶是中國十大名茶之一［11］，福鼎大白茶是都勻毛尖茶的一個原料品種。茶樹在轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和基因組等方面已有相關研究［12-15］，但是茶的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡方面研究較少。此外，茶樹的大多數(shù)生命活動都與蛋白質(zhì)相互作用密切相關。本研究利用三代Nanopore測序技術和同源比對的方法預測福鼎大白茶葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，并對網(wǎng)絡進行功能模塊預測、拓撲屬性分析、集群注釋和聚類分析，以期為尋找關鍵蛋白、鑒定蛋白質(zhì)的功能和選育福鼎大白茶優(yōu)良品種等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441），ONT SQK-LSK109試 劑 盒 ，Nanodrop2000，Agilent RNA 6000 Nano Kit，SuperscriptⅣ reverse transcriptase，數(shù)字3×32PCR儀，PromethⅠ-ON測序儀，Cytoscape3.3.0和Cytoscap3.8.2軟件，ClusterViz軟件，Blast2GO v2.5。

1.2 方法

1.2.1 取樣 試驗材料選取黔南民族師范學院基地扦插的福鼎大白茶，在本實驗室培育的茶苗中選取培養(yǎng)條件相同、長勢情況基本一致、沒有被污染過的茶苗植株9株，分為3組，每組3株，每株取5片嫩葉分別放入離心管中并迅速放入液氮中，將9個樣本放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 差異表達分析 從-80℃冰箱取出福鼎大白茶的根莖葉共9個樣品，送至北京百邁客生物科技有限公司進行三代Nanopore測序，并利用CPM［16］進行基因表達量的分析，再對葉與根、葉與莖、莖與根的差異表達基因進行分析，將差異基因與STRING v11.5［17］數(shù)據(jù)庫進行同源比對得到葉與根、葉與莖、莖與根的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。這3個網(wǎng)絡用Cytoscape3.3.0［18］軟件進行可視化，最后對3個差異基因網(wǎng)絡進行合并，得到根、莖、葉的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，并對網(wǎng)絡進行功能模塊預測、拓撲特性分析、集群注釋和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 關鍵蛋白質(zhì)的篩選

利用Nanopore測序方法獲得福鼎大白茶葉、根和莖的全長轉(zhuǎn)錄組，然后利用CPM分別計算出葉、根和莖中基因的表達量，篩選出葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉的差異表達基因，將差異表達基因與STRING數(shù)據(jù)庫進行同源比對獲得葉與根、葉與莖、莖與根以及根、莖、葉的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（圖1）。4個網(wǎng)絡分別有2 951、1 717、1 420、3 704個蛋白，33 131、12 939、8 092、49 545個互作。然后利用Cytoscape3.3.0軟件篩選出4個網(wǎng)絡中度最大的關鍵蛋白分別有53、39、42和53個（表1）。圖1中V形、三角形、正方形、平行四邊形、菱形和六邊形節(jié)點代表關鍵蛋白。將4個網(wǎng)絡中的蛋白與GO、Swiss-Prot和NR 3個數(shù)據(jù)庫比對，預測出4個網(wǎng)絡中的幾個關鍵蛋白的功能。TEA003744存在于葉綠體膜上，具有蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性和ATP結合性，參與光合作用和蛋白質(zhì)磷酸化過程。TEA026776具有蛋白激酶活性和ATP結合活性，參與蛋白質(zhì)磷酸化過程。TEA019056具有RNA聚合酶Ⅱ羧基末端結構域激酶活性和ATP結合活性，參與蛋白質(zhì)磷酸化過程。TEA005686具有激酶活性，參與磷酸化過程。TEA007967具有蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、2烯醛還原酶活性和ATP結合活性，參與氧化還原和蛋白質(zhì)磷酸化過程。TEA016315具有MAP激酶活性和ATP結合活性，參與MAPK級聯(lián)反應。這些關鍵蛋白在茶樹生長過程中具有重要作用。

圖1 差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡Fig.1 Protein-protein interaction network of DEGs

表1 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的關鍵蛋白Table 1 The hub proteins in the PPIN

2.2 功能模塊

利用Cytoscape3.3.0軟件的插件MCODE預測葉與根、葉與莖、莖與根及根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的功能模塊，4個網(wǎng)絡得分最高的功能模塊分別為23.07，44個節(jié)點（蛋白）、496條邊（互作）；25.026，40個節(jié)點、488條邊；17.846，27個節(jié)點、232條邊；39.278，73個節(jié)點、1 414條邊（圖2）。將4個功能模塊分別與GO、Swiss-Prot和NR進行比對，預測出4個功能模塊的功能，葉與根差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中得分最高的功能模塊的功能可能為蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結合活性、蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性，可能參與蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程；葉與莖的功能模塊可能為蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結合活性、核苷酸結合活性、蛋白激酶活性，可能參與蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程；莖與根的功能模塊可能為ATP結合活性、微管結合活性、ATP酶活性活性，可能參與基于微管的運動等生物過程；根莖葉功能模塊可能為蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結合活性、蛋白激酶活性等，可能參與蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程。通過功能模塊可以得到各功能模塊中的蛋白具有與功能模塊相關的功能。

圖2 4個網(wǎng)絡得分最高的功能模塊Fig.2 The four functional modules with the highest scores

2.3 拓撲屬性

利用Cytoscape3.3.0軟件對葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡進行拓撲特性分析［19］。度是指網(wǎng)絡中的一個點與其他點的連接數(shù)，度分布指網(wǎng)絡中度為k的節(jié)點出現(xiàn)的概率，本研究發(fā)現(xiàn)這4個網(wǎng)絡的度分布服從冪律分布規(guī)律，葉與根差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中 P（k）=725.42k-1.195，R2=0.708，相關性為 0.958；葉與莖 P（k）=544.77k-1.262，R2=0.790，相關性為 0.954；莖與根 P（k）=583.50k-1.388，R2=0.777，相關性為0.919；根莖葉 P（k）=867.73k-1.191，R2=0.714，相關性為0.953（圖3A）。中介中心性指網(wǎng)絡中兩個節(jié)點經(jīng)過其他為中介節(jié)點的最短路徑的個數(shù)，其計算公式見式（1），值介于0和1之間（圖3B）。

接近中心性是指網(wǎng)絡中某個節(jié)點與其他點之間的接近程度［20］，其計算公式見式（2）。

式中，L（j，i）是指從節(jié)點 j到i的最短路徑，其值也介于0和1之間（圖3C）。

聚合系數(shù)計算公式見式（3）。

式中，ka指節(jié)點a的全部鄰居數(shù)；ea指全部鄰居節(jié)點的連接邊數(shù)（圖3D）。

路徑的長度是形成路徑的邊數(shù)，可能有多個路徑連接兩個給定節(jié)點。兩個節(jié)點a和b之間的最短路徑長度用L（a，b）表示（圖3E）。拓撲系數(shù)是一個節(jié)點與其他節(jié)點共享鄰居的程度的相對度量［21］，拓撲系數(shù)計算公式見式（4）。

圖3 根莖葉差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡拓撲屬性Fig.3 Topological properties of the PPIN in root-stem-leaf

式中，J（a，b）是指所有節(jié)點a至少跟節(jié)點b共享一個鄰居節(jié)點，它的值是節(jié)點a和b共享的鄰居節(jié)點數(shù)（圖3F）。

利用Cytoscape3.8.2軟件中的插件CytoNCA對葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡進行分析，得出部分蛋白質(zhì)的中心性值的排名，進一步分析可知，葉與根的差異基因 TEA026776、TEA019056、TEA003744的度中心性和特征向量中心性分別為389.0和0.14 099 002，排名第一；TEA026734的中介中心性為141 918.7，排名第一；葉與莖的差異基因TEA019056、TEA003744的度中心性、特征向量中心性分別為231.0、0.176 189 48，排名第一；TEA005686的中介中心性為92 430.77，排名第一。莖與根的差異基因TEA003744度中心性、特征向量中心性分別為199.0、0.215 793 98，排名第一；TEA024522的中介中心性為118 051.8，排名第一。根莖葉的差異基因TEA026776、TEA019056、TEA003744的度中心性、特征向量中心性分別為492.0、0.128 961 82，排名第一，TEA005686的中介中心性為215 518.08，排名第一。排名越靠前代表這個蛋白質(zhì)越重要。通過對拓撲特性的分析表明這4個網(wǎng)絡是可靠的，符合一般網(wǎng)絡的特性。

2.4 集群注釋和聚類分析

2.4.1 集群注釋 通過Cytoscape3.8.2軟件中的插件AutoAnnotate［9］對4個網(wǎng)絡進行集群注釋，葉與根有24個集群，葉與莖有19個集群，莖與根有13個集群，根莖葉有17個集群。集群根據(jù)所選屬性的詞頻自動生成集群標簽，這些集群突出了蛋白質(zhì)的共享關系。每個集群折疊成一個“元節(jié)點”并將集群之間的邊緣折疊成一個“元邊緣”來創(chuàng)建一個簡化的視圖，有助于蛋白功能預測，即在一個集群中的蛋白質(zhì)可能具有相似的功能。

2.4.2 聚類分析 聚類是將數(shù)據(jù)分成一簇或一類，在同一簇或一類比不同簇更具有相似性。通過 Cytoscape3.8.2 軟件中的插件 ClusterViz［22］的典型FAG-EC算法對4個網(wǎng)絡進行聚類分析，分別得到211、163、136、244個聚類簇，對節(jié)點數(shù)多的聚類簇進行分析（表2），通過聚類分析可幫助識別蛋白質(zhì)功能模塊和預測蛋白質(zhì)功能［23］。

表2 4個網(wǎng)絡節(jié)點數(shù)多的聚類簇Table 2 The clusters with a large number of nodes among the four networks

3 討論

利用同源比對方法得到葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。4 個網(wǎng)絡分別有2 951、1 717、1 420、3 704個蛋白，33 131、12 939、8 092、49 545個互作。根據(jù)網(wǎng)絡可以預測出關鍵蛋白和蛋白質(zhì)的功能。預測出4網(wǎng)絡中的關鍵蛋白分別有53、39、42和53個。通過對網(wǎng)絡進行拓撲屬性分析得出預測的網(wǎng)絡較可靠；通過對網(wǎng)絡進行功能模塊分析，可以預測蛋白質(zhì)的功能。研究結果為鑒定蛋白質(zhì)的功能和選育福鼎大白茶優(yōu)良品種等提供了理論依據(jù)。

本研究利用三代Nanopore測序技術對都勻福鼎大白茶根莖葉進行全長轉(zhuǎn)錄組測序，并利用同源比對方法得到葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。使用Cytoscape3.3.0軟件篩選出葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中度最大的關鍵蛋白，分別為53、39、42和53個，并預測出關鍵蛋白的功能。結果表明葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中關鍵蛋白相互作用最多的5個蛋白TEA003744、TEA026776、TEA019056、TEA007967、TEA016315的分子功能都具有ATP結合活性，TEA003744、TEA026776、TEA019056、TEA007967蛋白都與蛋白質(zhì)磷酸化生物過程有關，TEA003744、TEA007967蛋白的分子功能都具有蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，其他關鍵蛋白分子功能各異，例如，TEA003744具有光合作用、光反應的調(diào)節(jié)能力；TEA026776具有蛋白激酶活性；TEA019056具有RNA聚合酶Ⅱ羧基末端結構域激酶活性；TEA005686具有激酶活性、磷酸化功能；TEA007967具有2-烯醛還原酶［NAD（P）］活性、氧化還原過程；TEA016315具有MAPK級聯(lián)反應、MAP激酶活性。以上結果表明，具有相同功能的關鍵蛋白表明在不同器官中具有相同的作用，是福鼎大白茶的生長發(fā)育過程中必不可少的蛋白。功能不同的關鍵蛋白在福鼎大白茶的不同部位發(fā)揮獨特的作用以完成茶樹的生命過程。TEA003744是蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有ATP結合功能；TEA019056是RNA聚合酶Ⅱ羧基末端結構域激酶，具有ATP結合功能；TEA005686具有激酶活性的功能，都參與信號轉(zhuǎn)導，該結果與二代轉(zhuǎn)錄組的結果［24］一致。

通過插件MCODE對網(wǎng)絡進行功能模塊分析，若一個功能模塊的功能已知，其中所有的蛋白可能具有與之相關的功能，或者是根據(jù)功能模塊中大部分蛋白的功能來推測功能模塊的功能。在葉與根的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的功能模塊中由 于 TEA005819、 TEA003983、 TEA009758、TEA012564、TEA016721、TEA018506具有ATP結合和轉(zhuǎn)移酶活性，因此推測其他非特征蛋白TEA021959、TEA005388、TEA013868也可能具有ATP結合和轉(zhuǎn)移酶活性等類似功能，通過這種方法可以預測出網(wǎng)絡中其他非特征蛋白質(zhì)的功能。本文預測出的功能模塊與前人相關研究［25-26］的功能模塊特征一致。因此，功能模塊對于預測蛋白質(zhì)的功能具有重要的作用，為培育優(yōu)良茶苗奠定了理論基礎。

通過拓撲屬性分析，得出4個網(wǎng)絡是比較可靠的，它符合網(wǎng)絡的一般特性與Li［25］的網(wǎng)絡特性一致。中心性排名越靠前則該蛋白越重要，說明以上蛋白質(zhì)在網(wǎng)絡中是核心蛋白，如果缺失或去掉，該網(wǎng)絡則會癱瘓。集群注釋和聚類分析的結果可為后期分子生物學分析提供一定的理論依據(jù)［27］。本研究為都勻福鼎大白茶關鍵蛋白及功能預測提供了一定的理論依據(jù)，并為選育優(yōu)良品種等提供了參考。