石 甜 莫忠妹 吳 敏 趙 財(cái)

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴陽(yáng) 550025）

薤白（）又名小根蒜，為石蒜科（Amaryllidaceae）蔥屬（）多年生宿根性草本植物，野生于山野和田間，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布。薤白可作食用，鱗莖也可藥用，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是重要的藥食同源植物之一，具有理氣寬胸和行氣導(dǎo)滯等功能。目前，對(duì)薤白的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用及生藥來(lái)源等方面。少數(shù)學(xué)者對(duì)薤白的系統(tǒng)發(fā)育、親緣演化關(guān)系等方面進(jìn)行了研究，如黃德青等利用ITS 和LF序列探討了薤白的系統(tǒng)位置，認(rèn)為其可能代表一個(gè)新的組一級(jí)類(lèi)群；楊鵬等和莫忠妹等分別對(duì)貴州和西南地區(qū)的薤白進(jìn)行了親緣關(guān)系研究，支持薤白作為一個(gè)單系類(lèi)群，并認(rèn)為其親緣關(guān)系與其地理位置具有一定相關(guān)性。

地質(zhì)歷史和氣候振蕩是植物進(jìn)化和遺傳結(jié)構(gòu)形成的重要驅(qū)動(dòng)因素。新生代以來(lái)，特別是第四紀(jì)冰期，不同緯度地區(qū)動(dòng)植物區(qū)系的地理分布格局、遺傳分化和生態(tài)適應(yīng)性受到寒暖氣候變動(dòng)、冰期和間冰期反復(fù)交錯(cuò)、地質(zhì)事件及季風(fēng)波動(dòng)的較大影響。中國(guó)地形地勢(shì)西高東低，地形多種多樣，地貌類(lèi)型復(fù)雜多樣，自然環(huán)境存在較大差異。青藏高原強(qiáng)烈抬升是最重要的地質(zhì)事件之一，其改變了全球氣候并激發(fā)了東亞季風(fēng)，使我國(guó)植物區(qū)系經(jīng)向分帶愈發(fā)明顯。中國(guó)因其特殊的地理位置和復(fù)雜的氣候環(huán)境，具有豐富的植物多樣性和獨(dú)特性。雖然在冰期時(shí)中國(guó)大部分地區(qū)沒(méi)有被大規(guī)模的冰層覆蓋，但全球氣候發(fā)生了大規(guī)模變化，尤其是第四紀(jì)冰期和間冰期周期性交替造成的寒冷和溫暖氣候變化引起的氣候波動(dòng)和青藏高原抬升影響了季風(fēng)強(qiáng)度進(jìn)而影響當(dāng)?shù)貧夂虿▌?dòng)，干濕交替深刻影響植物在中國(guó)的地理分布格局和歷史演化進(jìn)程。同時(shí)，復(fù)雜的地質(zhì)運(yùn)動(dòng)、環(huán)境異質(zhì)性和河流襲奪也深刻影響著現(xiàn)存植物的地理分布格局和種群遺傳結(jié)構(gòu)。

薤白作為草本植物，分布范圍廣，跨越不同氣候帶和多個(gè)生物多樣性研究熱點(diǎn)區(qū)域，是進(jìn)行廣布連續(xù)分布植物譜系地理學(xué)研究的理想材料。同時(shí)，草本植物對(duì)氣候變化和環(huán)境波動(dòng)敏感，DNA 堿基替換速率高于木本植物，能夠提供更多的歷史演化信息。目前，有關(guān)薤白譜系地理學(xué)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究首次采集中國(guó)整個(gè)分布區(qū)的14 個(gè)薤白居群，利用葉綠體基因（AH16 和L-F）和核基因（ITS）序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及測(cè)序，用以研究其譜系地理結(jié)構(gòu)，探討其遺傳結(jié)構(gòu)及單倍型的地理分布格局，并推測(cè)其在第四紀(jì)冰期的避難所，為進(jìn)一步探討中國(guó)植物區(qū)系演化及物種多樣性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

薤白材料于2016—2019年采自浙江、甘肅、吉林和四川等地，共14 個(gè)自然居群，各居群采集10～15個(gè)個(gè)體，位置信息采用全球定位系統(tǒng)測(cè)量（見(jiàn)表1）。野外采集薤白的新鮮葉片后立即用硅膠干燥保存，用于總DNA 提取。以蔥屬植物單花韭（）作為外類(lèi)群構(gòu)建單倍型系統(tǒng)樹(shù)。

表1 薤白居群地理分布信息Table 1 Geographical distribution information of populations of A.macrostemon

1.2 DNA 提取及擴(kuò)增測(cè)序

采用改良的CTAB 法從硅膠干燥的葉片中分離總基因組DNA。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，參照Hamil?ton、Oxelman 等、Taberlet 等和Wendel 等設(shè)計(jì)引物，利用3 對(duì)葉綠體基因片段（A-H16 和L-F）和核基因ITS 序列，獲取引物序列并合成引物，用于篩選適合的基因片段。引物序列及PCR 擴(kuò)增程序見(jiàn)表2。將擴(kuò)增后檢測(cè)結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化及測(cè)序。

表2 PCR引物信息及反應(yīng)程序Table 2 Primer and protocols of PCR

1.3數(shù)據(jù)分析

利用DNAstar軟件和MEGA 7.0軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行編輯和手工核對(duì)調(diào)整。運(yùn)用DNaSP 5.0 軟件統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)量，計(jì)算各居群?jiǎn)伪缎投鄻有裕ǎ?、核苷酸多樣性（）、Tajima’s值以及Fu & Li’s值，并進(jìn)行失配分析以檢測(cè)是否經(jīng)歷擴(kuò)張事件。薤白總遺傳多樣性（）、居群內(nèi)平均遺傳多樣性（）、遺傳分化系數(shù)（和）利 用PERMUT 計(jì) 算?；?于 簡(jiǎn) 約 性 原 則 利 用Network 軟件中的Median-Joining 構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。利用Arlequin 軟件包中的AMOVA 分析計(jì)算群體遺傳結(jié)構(gòu)以及檢測(cè)居群內(nèi)和居群間遺傳變異，并計(jì)算遺傳分化系數(shù)（），基因流（）進(jìn)一步揭示居群的分化程度。以近緣種單花韭為外類(lèi)群，利用MEGA 7.0 軟件和MrBayes 3.2.1軟件分別采用鄰接法（NJ）、最大似然法（ML）和貝葉斯法（BI）構(gòu)建的葉綠體及核基因單倍型系統(tǒng)樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1薤白葉綠體單倍型和核基因基因型序列變異與遺傳多樣性

薤白葉綠體A-H+16+L-F 聯(lián)合序列成功測(cè)序160個(gè)個(gè)體，測(cè)序所得數(shù)據(jù)對(duì)位排列后序列長(zhǎng)度為1 930 bp，包含9 個(gè)變異位點(diǎn)，G+C 含量為35.52%（見(jiàn)表3）。運(yùn)用DNaSP 軟件得出薤白總單倍型多樣性為0.866，大盤(pán)山（DPS）和天水（TSS）的單倍型多樣性最高（0.545）；總核苷酸多樣性為0.780×10，大盤(pán)山（DPS）具有最高的核苷酸多樣性（0.34×10）（見(jiàn)表4）。薤白ITS 序列成功測(cè)序165個(gè)個(gè)體，經(jīng)比對(duì)后其長(zhǎng)度為633 bp，包含214個(gè)變異位點(diǎn)，G+C 含量為50.22%?？倖伪缎投鄻有詾?.835，劍閣（JGX）具有最高單倍型多樣性（0.667）；總核苷酸多樣性為64.78×10，其中天水（TSS）核苷酸多樣性最高，為7.170×10（見(jiàn)表4）。

表3 psbA-trnH、rps16、trnL-F及ITS序列信息Table 3 Information of psbA-trnH，rps16，trnL-F and ITS

表4 薤白居群內(nèi)單倍型分布及多態(tài)性信息Table 4 Haplotype distribution and polymorphism of haplotypes in population of A.macrostemon

2.2薤白葉綠體和核基因單倍型分布與種群遺傳結(jié)構(gòu)

對(duì)A-H+16+L-F 聯(lián)合序列進(jìn)行了單倍型檢測(cè)，共得到11 個(gè)單倍型（H1～H11），其中單倍型H3 的個(gè)體數(shù)為35 個(gè)，出現(xiàn)的頻率最高，分布范圍最廣，在大盤(pán)山（DPS）、內(nèi)蒙古（NMG）及銀川（YCS）均有分布；其次為單倍型H5，分布在廣州（GZS）、黃石（HSS）及通化（THS）（見(jiàn)圖1）?；诤嘶騃TS序列共得到15個(gè)基因型（H1-H15）。其中單倍型H1 的頻率最高，包含60 個(gè)個(gè)體，在大盤(pán)山（DPS）、黃石（HSS）、懷化（HHS）、信陽(yáng)（XYS）、福州（FZS）均有分布（見(jiàn)圖2）。薤白的葉綠體單倍型網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，以單倍型H3 和H5 為中心分別衍生出其他單倍型，推測(cè)H3 和H5 為古老單倍型（見(jiàn)圖3A）。薤白的核基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示薤白以單倍型H1 為中心，衍生出H2 和H6 兩個(gè)單倍型，同時(shí)衍生出其他單倍型，推測(cè)H1 為古老單倍型（見(jiàn)圖3B）。以近緣種單花韭為外類(lèi)群，利用MEGA 7.0 軟件分別構(gòu)建葉綠體及核基因單倍型系統(tǒng)樹(shù)，建樹(shù)結(jié)果與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖基本吻合（見(jiàn)圖4）。利用核DNA 序列的15 種單倍型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，單倍型H1、H2、H6 與H11～H15聚為一支；其余單倍型聚為一支（見(jiàn)圖4）。

圖1 薤白14個(gè)居群葉綠體單倍型地理分布餅狀圖表示每個(gè)居群中單倍型的頻率，下同F(xiàn)ig.1 Haplotype geographical distribution of chloroplast sequences in natural populations of A.macrostemonThe pie chart shows the frequency of haplotypes in each population，the same as below

圖2 薤白14個(gè)居群核基因單倍型地理分布Fig.2 Haplotype geographical distribution of nuclear sequences in natural populations of A.macrostemon

圖3 薤白種群?jiǎn)伪缎途W(wǎng)絡(luò)A.葉綠體；B.核基因Fig.3 Haplotype network of A.macrostemon populationsA.The haplotype network of chloroplast sequences；B.The haplotype network of nuclear sequences

圖4 薤白單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)A.葉綠體基因單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；B.核基因單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；分支上的數(shù)字分別代表NJ樹(shù)、ML樹(shù)和BI樹(shù)的支持率，未標(biāo)明支持率處表示NJ樹(shù)、ML樹(shù)和BI樹(shù)存在略微差異Fig.4 The phylogenetic tree of A.macrostemonA.The phylogenetic tree of cpDNA haplotypes；B.The phylogenetic tree of nrDNA haplotypes；The Numbers on the branches represent the support rates of NJ，ML and BI trees respectively，and the unmarked support rates indicate that there is a difference among NJ，ML and BI trees

利用PERMUT 計(jì)算得出，薤白葉綠體片段總遺傳多樣性為0.868，居群內(nèi)平均遺傳多樣性為0.111；居群間遺傳分化系數(shù)為0.866、為0.918（>0.05）；基因流為0.019。核基因片段總遺傳多樣性為0.890，居群內(nèi)平均遺傳多樣性為0.130；居群間遺傳分化系數(shù)為0.855、為0.984（>0.05）；基因流為0.004。AMOVA 分析結(jié)果顯示，葉綠體基因和核基因在薤白居群間遺傳變異（cpDNA：92.84%；nrDNA：98.40%）顯著高于居群內(nèi)遺傳變異（cpDNA：7.16%；nrDNA：1.60%），說(shuō)明遺傳變異主要存在于居群間。遺傳分化系數(shù)均大于0.25（cpDNA：0.928；nrDNA：0.984），說(shuō)明薤白群體的遺傳分化程度很高，存在明顯的隔離（見(jiàn)表5），且葉綠體和核基因序列居群間遺傳分化系數(shù)均為>，表明該物種具有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。

表5 薤白種群的分子方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of molecular variance（AMOVA）in A.macrostemon populations

2.3種群歷史變化動(dòng)態(tài)分析

利用DNaSP5.0軟件對(duì)薤白的Tajima’s值以及Fu&Li’s值進(jìn)行計(jì)算，得出其葉綠體基因Ta?jima’s統(tǒng)計(jì)值為-0.040 56（>0.10）；Fu & Li’s值為1.225 72（>0.10）；Fu & Li’s值為0.930 56（>0.10）；Fu’s值 為-1.723。此 外，利 用DNaSP5.0對(duì)薤白進(jìn)行失配分析以檢測(cè)是否經(jīng)歷擴(kuò)張事件，其葉綠體失配分析曲線呈單峰分布（見(jiàn)圖5A）。這些研究結(jié)果表明，薤白經(jīng)歷過(guò)近期擴(kuò)張過(guò)程。同時(shí)，利用DNaSP5.0 計(jì)算得出的核基因Taji?ma’s統(tǒng)計(jì)值為0.111 90（>0.10）；Fu&Li’s值為2.866 30（<0.02）；Fu & Li’s值為1.874 44（<0.05）；Fu’s值為50.426。利用DNaSP5.0 完成的核基因失配分析曲線為多峰曲線（見(jiàn)圖5B），期望值與觀測(cè)值相悖，違背居群擴(kuò)張模型，說(shuō)明薤白居群并未經(jīng)歷顯著的群體擴(kuò)張，而是處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

圖5 薤白種群失配分析A.葉綠體基因失配分析；B.核基因失配分析Fig.5 Mismatch analysis of A.macrostemonA.The mismatch analysis of cpDNA；B.The mismatch analysis of nrDNA

3 討論

3.1遺傳多樣性

本研究利用的葉綠體基因A-H+16+L-F聯(lián)合序列結(jié)果顯示，葉綠體基因遺傳變異高于被子植物葉綠體DNA 的平均遺傳多樣性0.67，核基因ITS 序列變異也高于核基因變異平均值0.137。遺傳多樣性與物種地理分布、生物學(xué)特性、種群大小及繁育體系等諸多因素相關(guān)。目前，利用不同分子標(biāo)記探討草本植物遺傳多樣性的研究較多，如無(wú)苞香蒲（）、寬葉香蒲（）和長(zhǎng)苞香蒲（）結(jié)果顯示其遺傳多樣性較低，可能與其具有較高的自交率和較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)繁殖能力有關(guān)。本研究中，薤白居群間葉綠體遺傳多樣性和核苷酸多樣性都低于核基因，這可能是與葉綠體基因的相對(duì)保守性及其母系遺傳方式相關(guān)，葉綠體DNA 片段的基因流大部分是通過(guò)種子來(lái)傳播，而核基因的基因流傳播方式包括花粉和種子。此外，分布狹窄的物種遺傳多樣性低于廣布種，而薤白為廣布種，數(shù)量較大，適應(yīng)性較強(qiáng)，可以保留相對(duì)豐富的遺傳多樣性，這也是一個(gè)薤白遺傳多樣性較高的原因。

3.2遺傳結(jié)構(gòu)

地質(zhì)歷史氣候變化、地勢(shì)條件、生境異質(zhì)性，以及種子基因交流程度等諸多因素與植物種群的遺傳結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)葉綠體A-H+16+L-F 聯(lián)合片段分析，結(jié)果顯示居群遺傳分化系數(shù)小于，表明居群間存在顯著的譜系地理結(jié)構(gòu)?？傔z傳多樣性顯著高于居群內(nèi)平均遺傳多樣性，說(shuō)明薤白居群間沒(méi)有頻繁的基因交流，而基因流（=0.019）數(shù)值較低，也證實(shí)薤白居群間僅存在較低的基因交流。這一結(jié)果與其他物種的研究結(jié)果一致，如基于cpDNA 聯(lián)合數(shù)據(jù)對(duì)迎紅杜鵑亞屬特有種進(jìn)行的遺傳結(jié)構(gòu)分析，顯示該亞屬兩個(gè)種的遺傳變異主要存在于居群間，且顯著小于，說(shuō)明具有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)；朱仁斌對(duì)文冠果（）的遺傳結(jié)構(gòu)分析得出該物種居群間出現(xiàn)強(qiáng)烈的遺傳分化，居群間基因流較小，存在譜系地理結(jié)構(gòu)（<）?；趯?duì)核基因ITS 序列分析，可知薤白居群<（=0.855，=0.984，>0.05），表明居群間存在顯著的譜系地理結(jié)構(gòu)。總遺傳多樣性（=0.890）與居群內(nèi)平均遺傳多樣性（=0.130）差值較大，基因流（=0.004）數(shù)值較低，薤白居群間只存在很低的基因交流，說(shuō)明薤白居群間沒(méi)有頻繁的基因交流。

通過(guò)對(duì)葉綠體基因和核基因分析顯示大于，表明薤白的地理分布存在譜系地理結(jié)構(gòu)，與基于單倍型數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分支結(jié)果一致，形成了與遺傳距離相關(guān)的譜系地理格局。AMO?VA 分析結(jié)果顯示，葉綠體基因和核基因在薤白居群間遺傳變異分別為92.84%和98.40%，均顯著高于居群內(nèi)遺傳變異，說(shuō)明薤白遺傳變異存在于居群間。葉綠體基因和核基因的中性檢驗(yàn)都不支持種群經(jīng)歷過(guò)擴(kuò)張，但葉綠體歧點(diǎn)分布支持種群擴(kuò)張模式，而核基因歧點(diǎn)分布不支持空間擴(kuò)張模式。綜上所述，認(rèn)為薤白居群沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)近期擴(kuò)張，這可能是薤白種子結(jié)實(shí)率低、不易向外擴(kuò)散傳播及生境原因；并且本研究結(jié)果顯示，薤白14個(gè)居群間葉綠體基因和核基因的基因流僅為0.019 和0.004，因此認(rèn)為地理隔離引起的有限基因流也是造成薤白居群間存在顯著遺傳分化的原因之一。

3.3薤白種群地理分布格局及冰期避難所

冰期避難所是由于極端環(huán)境變化而導(dǎo)致物種遷移和生存的地方。根據(jù)冰川避難所理論，遺傳多樣性高、古單倍型和地方性單倍型較多的地區(qū)可能是該物種在冰期的避難所，這些區(qū)域在環(huán)境波動(dòng)期間具有相對(duì)穩(wěn)定的生態(tài)條件，因此促進(jìn)了遺傳多樣性的積累。薤白在我國(guó)不同地區(qū)復(fù)雜的地形及環(huán)境中均有分布，在適應(yīng)不同生境過(guò)程中，它們經(jīng)歷了不同的遺傳歷史，而生境片段化和人為干擾會(huì)導(dǎo)致其具有譜系地理結(jié)構(gòu)和強(qiáng)烈的遺傳分化。第四紀(jì)冰期期間，全球范圍氣候和地勢(shì)條件產(chǎn)生巨大變動(dòng)，對(duì)所有動(dòng)植物都造成很大影響，導(dǎo)致生物物種進(jìn)行地理位置上大規(guī)模的轉(zhuǎn)移。根據(jù)溯祖理論，一般位于單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中間位置的為古老單倍型，可據(jù)此推斷避難所位置。

李慧敏對(duì)槲樹(shù)（）進(jìn)行冰期避難所推測(cè)，認(rèn)為末次間冰期時(shí)秦巴山區(qū)為槲樹(shù)最大的冰期避難所，而長(zhǎng)白山地區(qū)可能是槲樹(shù)的另一個(gè)冰期避難所；張華杰揭示在冰期時(shí)期，山莓草（）在亞洲存在幾個(gè)避難所，其中我國(guó)東北長(zhǎng)白山和日本是山莓草在亞洲的重要避難所，青藏高原東部存在多個(gè)微型避難所；對(duì)大花旋蒴苣苔（）的譜系地理學(xué)研究也認(rèn)為東部地區(qū)存在其冰期避難所。本研究中，結(jié)合cpDNA序列和ITS序列進(jìn)行分析，大盤(pán)上、天水和通化等地區(qū)顯示出較高的遺傳多樣性，并且存在古老單倍型。結(jié)合前人研究，推測(cè)薤白在第四紀(jì)冰期時(shí)可能在分別位于東部、秦嶺和長(zhǎng)白山的大盤(pán)山、天水和通化地區(qū)存在幾個(gè)冰期避難所。這些分析可為類(lèi)似草本植物的進(jìn)化提供參考，豐富我們對(duì)東亞草本植物分子系統(tǒng)與生物地理學(xué)的認(rèn)識(shí)。