劉禹志 ，趙文俊，符樹(shù)勇 ，張誠(chéng) ，杜冰，方嘉沁 *

1. 廣州酒家集團(tuán)利口福食品有限公司（廣州 511442）；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（廣州 510642）；3. 廣州酒家集團(tuán)糧豐園（茂名）食品有限公司（茂名 525000）；4. 廣州市廣式焙烤食品加工工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心（廣州 511442）

龍眼、荔枝和芒果常見(jiàn)于我國(guó)海南、廣東等熱帶和亞熱帶省份，其果肉鮮嫩多汁、營(yíng)養(yǎng)可口，它不僅富含鈣、鎂、磷等多種礦物質(zhì)和核黃素、煙酸等維生素，還含有多種抗氧化活性物質(zhì)如槲皮素、原花青素等類黃酮物質(zhì)，對(duì)人體多有裨益[1-2]。龍眼（Dimocarpus longan Lour.）亦稱“桂圓”，盛產(chǎn)于我國(guó)華南地區(qū)。龍眼具有壯陽(yáng)益氣、補(bǔ)心益脾、潤(rùn)膚美容、延年益壽等功效，可以治療或改善貧血、心悸、神經(jīng)衰弱等癥狀[3]。芒果（Mangifera indicaL.）是我國(guó)廣西、海南、四川和云南等熱區(qū)農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，芒果果實(shí)富含糖、蛋白質(zhì)、粗纖維，并且所含有的維生素A的前體胡蘿卜素成分特別高，是所有水果中少見(jiàn)的。但是這些季節(jié)性水果采收后不易貯存而導(dǎo)致腐爛的問(wèn)題，給食品工業(yè)造成巨大的損失[4]，如何保持農(nóng)產(chǎn)品的價(jià)值成為現(xiàn)實(shí)亟需解決的問(wèn)題。近年來(lái)，為滿足人們不同人群口味的需求，焙烤行業(yè)迅猛發(fā)展，特別是中秋時(shí)節(jié)的特色月餅層出不窮，這引起了廣大消費(fèi)者的青睞，從而為荔枝、龍眼、芒果的混果餡料的加工提供新思路。

復(fù)合益生菌發(fā)酵因其在增強(qiáng)風(fēng)味、強(qiáng)化發(fā)酵性能、提高發(fā)酵效率等[5]方面有著重要的作用而備受青睞，相較于單菌發(fā)酵，經(jīng)多菌種協(xié)同發(fā)酵后，產(chǎn)品風(fēng)味可以得到很大改善[6]。例如，賈瑞娟等[5]利用復(fù)合菌種發(fā)酵生產(chǎn)的陳醋，其產(chǎn)品的風(fēng)味顯著提高。眾所周知，植物乳桿菌在風(fēng)味發(fā)酵食品中起著重要的作用；DU-106是一種具有極高增殖能力的好氧型產(chǎn)乳酸芽孢桿菌，其基因組缺乏編碼致吐毒素合成酶、腸毒素FM和細(xì)胞毒素K的毒力基因，此外，Hoang等[7]也綜述了芽孢桿菌是比乳酸菌更耐pH、更廣譜的細(xì)菌素，可作為一種生物防腐劑。因此DU-106極具有成為食品工業(yè)中益生菌發(fā)酵劑和防腐劑的潛力。

試驗(yàn)旨在利用植物乳桿菌復(fù)合DU-106發(fā)酵荔枝、龍眼、芒果的混果餡料并探究其營(yíng)養(yǎng)成分變化和揮發(fā)性物質(zhì)變化，為農(nóng)產(chǎn)品的深加工提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)，對(duì)開(kāi)發(fā)一款綠色健康的水果飲料有積極的推動(dòng)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

新鮮荔枝、芒果和龍眼，購(gòu)于廣州市天河區(qū)五山超市；菌種選用乳酸芽孢桿菌DU-106以及植物乳桿菌，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源與功能性原料研究及評(píng)價(jià)中心鑒定及保藏；乳酸標(biāo)準(zhǔn)品試劑（上海源葉生物科技有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PHS-3C型PH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；UV-1100型紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；DHP600型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；QP2010 Ultra型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料前處理

選用新鮮荔枝、龍眼和芒果去皮去核后，按照質(zhì)量比3∶1∶2置入打漿機(jī)形成混合水果勻漿。將打好的混合水果漿液置于滅菌鍋中100 ℃蒸煮30 min，冷卻后接種復(fù)合菌種得到混果餡料，復(fù)合菌比例為植物乳桿菌∶乳酸芽孢桿菌DU-106=1∶1，接種量為混合果漿勻漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.1%，培養(yǎng)箱溫度設(shè)定參數(shù)為28 ℃，每隔24 h測(cè)定發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)成分及揮發(fā)性物質(zhì)。

1.3.2 發(fā)酵混果餡料營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

1.3.2.1 pH的測(cè)定

使用PHs-3C型pH計(jì)直接進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.2 總酸的測(cè)定

參照GB/T 12456—2008[8]中酸堿滴定法測(cè)定混果餡料樣品的總酸含量（以乳酸計(jì)，g/kg）。

1.3.2.3 可溶性固形物的測(cè)定

利用糖度計(jì)測(cè)定其中的可溶性固形物含量。

1.3.2.4 還原糖的測(cè)定

參考GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測(cè)定》[9]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.5 乳酸的測(cè)定

乳酸的測(cè)定將參照GB 5009.157—2016[10]中有機(jī)酸測(cè)定方法進(jìn)行。色譜條件：Amnex HPX-87H色譜柱；流動(dòng)相選用濃度為0.1%的磷酸水溶液；流速400 μL/min；柱溫40 ℃；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm；手動(dòng)進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 發(fā)酵混果餡料揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）測(cè)定混果餡料發(fā)酵前后的揮發(fā)性成分。

1.3.3.1 樣品前處理

參照雷冬明等[11]的方法，對(duì)混果餡料發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理。首先將固相微萃取針頭預(yù)先老化，將上述制得的混果餡料準(zhǔn)確稱取4 g送入15 mL頂空瓶中，在40 ℃的條件下水浴加熱30 min，隨后將老化好的萃取針頭插入頂空瓶，頂空萃取在40 ℃恒溫的條件下進(jìn)行30 min，隨后置入GC-MS進(jìn)樣口處在250 ℃下解吸2 min。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱選用HP-5毛細(xì)管柱；揮發(fā)性物質(zhì)升溫程序：選用不分流進(jìn)樣模式，初始溫度40 ℃，柱溫40 ℃，保持3 min。然后以5 ℃/min的升溫速率使溫度升至150 ℃，保持1 min。最后以10 ℃/min的升溫速率使溫度升至230 ℃，保持1 min；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min。

1.3.3.3 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜調(diào)諧類型為EI模式，電子能量為70 ev；離子源溫度230 ℃，MS四極桿溫度150 ℃；接口溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍30～400 amu；溶劑延遲為1.00 min；EM設(shè)置為增益因子1.003。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)樣品進(jìn)行三次平行測(cè)定，利用圖譜檢索對(duì)應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，使用GraphPad Prism 7作圖并分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料pH的影響

由圖1可知，混果餡料的初始pH為4.5，發(fā)酵初期的混果餡料的pH隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而逐步降低，主要是由于兩種產(chǎn)乳酸的菌種利用混果餡料中的乳糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致體系內(nèi)的pH下降。在發(fā)酵中期至后期的pH趨于穩(wěn)定，發(fā)酵第7天pH為3.4，其原因一方面，可能是由于混果餡料發(fā)酵液中乳糖的含量減少，益生菌進(jìn)入停滯生長(zhǎng)狀態(tài)，導(dǎo)致乳酸產(chǎn)生量減少甚至停止產(chǎn)生乳酸[12-13]。另一方面是由于發(fā)酵產(chǎn)生乳酸使得H+濃度過(guò)高，抑制了菌種的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致菌種的自溶現(xiàn)象[14]。發(fā)酵液維持在一定的pH可以提高混果餡料的保藏性能，同時(shí)，適宜的pH還能增加混果餡料的風(fēng)味和口感[6]。因此，發(fā)酵后的混果餡料其pH維持在3.4，能延長(zhǎng)果漿的貨架期。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料pH的影響

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料總酸和乳酸的影響

由圖2和圖3可知，混果餡料總酸和乳酸的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而在不斷上升，這是因?yàn)槿樗峋腿樗嵫挎邨U菌不斷產(chǎn)酸的結(jié)果。發(fā)酵前混果餡料總酸含量0.97 g/kg，發(fā)酵1周后總酸的含量高達(dá)14.22 g/kg，發(fā)酵前乳酸的含量為1.1 mg/g，發(fā)酵一周后達(dá)到了15.0 mg/g，這與圖1中發(fā)酵體系中pH的下降相對(duì)應(yīng)。乳酸含量的整體上升是總酸含量上升的關(guān)鍵因素，乳酸菌通過(guò)EMP途徑的主要代謝產(chǎn)物便是乳酸[15]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸芽孢桿菌與乳桿菌復(fù)合發(fā)酵能夠刺激乳桿菌提高其產(chǎn)酸能力[16]；賈瑞娟等[5]利用芽孢菌和醋酸菌、乳酸菌發(fā)酵山西老陳醋結(jié)果表明芽孢菌能夠提高產(chǎn)品的風(fēng)味。吳姍姍等[17]利用釀酒酵母171和乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵佛手果，結(jié)果表明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵佛手果酒中pH和可溶性固形物的含量逐漸下降，感官評(píng)分增加，說(shuō)明混菌發(fā)酵增強(qiáng)了香氣復(fù)雜性和層次感[18]。試驗(yàn)研究結(jié)果表明混果餡料中乳酸含量提高，擁有良好口感和風(fēng)味。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料總酸的影響

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料乳酸的影響

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料還原糖和可溶性固形物的影響

由圖4和圖5可知，混果餡料初始還原糖含量為5.63 g/100 g，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖含量逐步下降至發(fā)酵結(jié)束的4.95 g/100 g，可溶性固形物含量由發(fā)酵前的17.10%下降至發(fā)酵后的15.83%。這可能是因?yàn)檫€原糖是乳酸菌的發(fā)酵原料，供給乳酸菌繁殖和新陳代謝所需能量，故呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而發(fā)酵后還存在大量的還原糖和可溶性固形物，而且越到發(fā)酵后期，混果餡料中還原糖和可溶性固形物的含量趨于穩(wěn)定，可能是由于乳酸菌利用混果餡料中的乳糖而無(wú)法利用其他的糖類導(dǎo)致的，這與發(fā)酵后期pH的變化和總酸上升至趨于穩(wěn)定的結(jié)果相一致，這也可以說(shuō)明發(fā)酵液中沒(méi)有感染其他的雜菌，發(fā)酵狀態(tài)良好。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵后還原糖的含量并沒(méi)有急劇下降，說(shuō)明其主要營(yíng)養(yǎng)成分的變化不明顯，而且適當(dāng)?shù)奶呛磕茉黾羽W料的甜度，平衡pH下降導(dǎo)致過(guò)酸。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料還原糖的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料可溶性固形物含量的影響

2.2 混果餡料發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料揮發(fā)性成分的影響

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料揮發(fā)性物質(zhì)變化的影響

試驗(yàn)利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）來(lái)對(duì)混果餡料樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，分析結(jié)果見(jiàn)表1和圖6。未發(fā)酵前（發(fā)酵第0天）共檢測(cè)出27種揮發(fā)性物質(zhì)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，最多共產(chǎn)生47種揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)酵最后1天共檢測(cè)到24種揮發(fā)性物質(zhì)，可以看出發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)先增加后減少的趨勢(shì)，為了探究混果餡料中風(fēng)味的變化，將揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行歸類處理。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)間混果餡料中揮發(fā)性物質(zhì)氣相色譜圖

表1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料揮發(fā)性物質(zhì)的影響

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混果餡料揮發(fā)性物質(zhì)種類的影響

如圖7（A）所示，隨著發(fā)酵進(jìn)程的延長(zhǎng)，醇類物質(zhì)的變化呈波動(dòng)的趨勢(shì)，但總體的含量略微下降，由發(fā)酵前的9.01%降低至發(fā)酵結(jié)束后的7.79%。發(fā)酵過(guò)程中檢測(cè)出芳樟醇、香茅醇、香葉醇等物質(zhì)，芳樟醇作為全世界廣泛使用的香料，其帶有茶香，而香茅醇、香葉醇則帶有玫瑰和水果的香味，這些物質(zhì)都賦予了混果餡料的特別氣味[19-20]。如圖7（B）所示，發(fā)酵后烯類物質(zhì)是荔枝主要的揮發(fā)性成分，占比達(dá)到了27.58%，從發(fā)酵開(kāi)始到發(fā)酵結(jié)束期間不斷產(chǎn)生新的烯類物質(zhì)，而后又被降解。其中蒎烯、月桂烯、羅勒烯是混果餡料主要的烯類物質(zhì)的來(lái)源，并賦予果漿濃郁的果香和松木氣味[21-22]。如圖7（C）所示，發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性有機(jī)酸的含量上升，達(dá)到19.50%。圖7（D）顯示，揮發(fā)性烷類物質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而略微下降，烷烴類揮發(fā)性物質(zhì)曾在甲殼類水產(chǎn)品中被檢出，由于它們的閾值較高，因而對(duì)其整體的風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[23]。圖7（E）顯示揮發(fā)性胺類物質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。從圖7可以得出，發(fā)酵前后的混果餡料風(fēng)味差異很大，以醋酸為主的揮發(fā)性有機(jī)酸含量上升，賦予混果餡料一定的酸味，胺類物質(zhì)下降可以減輕混果餡料中令人不適的臭味?；旃W料中對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的是醇類和烯類的揮發(fā)性物質(zhì)，幾種揮發(fā)性物質(zhì)共同作用構(gòu)成了混果餡料特殊的風(fēng)味[24]。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)各類揮發(fā)性物質(zhì)變化的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)以荔枝、龍眼、芒果為原料制成的混果餡料經(jīng)過(guò)混菌發(fā)酵并測(cè)定其發(fā)酵過(guò)程的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)的變化情況，在植物乳桿菌和DU-106菌種1∶1復(fù)合發(fā)酵過(guò)程中，混果餡料中pH下降，還原糖、可溶性固形物含量下降，乳酸和有機(jī)酸的含量上升；發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化很大，烯類和有機(jī)酸類揮發(fā)性物質(zhì)上升，胺類揮發(fā)性物質(zhì)下降。醇類和烯類物質(zhì)構(gòu)成了混果餡料中主要的風(fēng)味物質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果為開(kāi)發(fā)新型的益生菌發(fā)酵工業(yè)提供了一定的理論基礎(chǔ)，為混菌發(fā)酵在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。