齊焱熠，陳 邦，趙鵬濤，劉 梁，孟永宏

(1.陜西師范大學(xué) 西部果品資源高值利用教育部工程研究中心，西安 710119； 2.西北大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，西安 710127)

羥基酪醇化學(xué)名為3，4-二羥基苯乙醇，是一種多酚類化合物，為無(wú)色或淺黃色油狀物，主要以酯化物的形式存在于油橄欖中。大量研究表明，羥基酪醇具有預(yù)防糖尿病[1]、防止神經(jīng)紊亂[2]、減少低密度脂蛋白氧化[3-4]、抗炎[5-7]、抗癌[8-10]、抗腫瘤[11-13]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[14-15]和抗氧化[16-18]等多種功能。但是，羥基酪醇的油溶性較差，限制了其在食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，將羥基酪醇修飾為酯類衍生物是一種有效的策略，不僅可顯著提高其油溶性，而且可提高其生物利用度[19-20]。Bouallagui等[20]以羥基酪醇和醋酸為原料合成了羥基酪醇醋酸酯，并研究了其抗氧化性。Yu等[21]首次從植物中分離出天然的羥基酪醇丁酸酯。Burattini等[22]研究了羥基酪醇月桂酸酯對(duì)過(guò)氧化氫引起細(xì)胞氧化損傷的影響。油酸是一種單不飽和脂肪酸，對(duì)軟化血管有一定作用。油橄欖中含有豐富的羥基酪醇，尤其是在橄欖油副產(chǎn)物中其含量較高。然而，橄欖油副產(chǎn)物一般被直接丟棄，不僅造成資源浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。目前對(duì)羥基酪醇油酸酯合成的研究較少。因此，本研究以羥基酪醇和油酸為底物，通過(guò)篩選脂肪酶和優(yōu)化反應(yīng)體系，合成了羥基酪醇油酸酯，為橄欖油副產(chǎn)物的高值化利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

羥基酪醇(99%)，陜西嘉禾生物科技股份有限公司；油酸(98%)、磷酸(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；2-甲基-2-丁醇(99%)，麥克林公司，甲醇(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；脂肪酶，具體信息見表1。

表1 脂肪酶的具體信息

1.1.2 儀器與設(shè)備

THZ-C恒溫振蕩搖床，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；RVC2-18CDplus真空離心濃縮儀，上海般諾生物科技有限公司；高分辨率液質(zhì)聯(lián)用儀、400 MHz核磁共振儀，德國(guó)布魯克公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羥基酪醇油酸酯的制備

參照文獻(xiàn)[20]采用脂肪酶催化酯化法合成羥基酪醇油酸酯，其反應(yīng)式如圖1所示。

圖1 脂肪酶催化羥基酪醇的酯化反應(yīng)式

稱取500 mg羥基酪醇于錐形瓶中，按一定摩爾比加入油酸，再加入一定體積的2-甲基-2-丁醇溶劑，加入一定量的脂肪酶(以整個(gè)反應(yīng)體系的質(zhì)量計(jì))，在一定溫度、200 r/min的搖床中反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心分離去除脂肪酶，再置于真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀除去溶劑，得到羥基酪醇油酸酯粗品。反應(yīng)過(guò)程中，取樣測(cè)定反應(yīng)液中羥基酪醇的含量，按公式(1)計(jì)算羥基酪醇轉(zhuǎn)化率(Y)。

Y=(C0-C1)/C0×100%

(1)

式中：C0、C1分別為反應(yīng)體系中反應(yīng)前和反應(yīng)后羥基酪醇的含量，mg/L。

1.2.2 羥基酪醇油酸酯的純化

將羥基酪醇油酸酯粗品依次用2倍體積的飽和碳酸氫鈉溶液和去除二氧化碳的純水分別洗滌3次，除去過(guò)量的油酸、未反應(yīng)的羥基酪醇和鹽溶液，得到高純度的羥基酪醇油酸酯。

1.2.3 羥基酪醇含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定。HPLC條件[23]：Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相A為100%甲醇，流動(dòng)相B為10%甲醇(磷酸調(diào)pH至3.0)；梯度洗脫程序?yàn)?～10 min 10% A，10～40 min 30% A，40～50 min 40% A，50～55 min 50% A,55～65 min 100% A，65～75 min 10% A；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫35℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

首先配制一系列不同質(zhì)量濃度的羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行分析，以羥基酪醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再將樣品溶液進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行分析，根據(jù)樣品溶液中羥基酪醇的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品溶液中羥基酪醇的含量。

1.2.4 質(zhì)譜、核磁分析

將羥基酪醇油酸酯用色譜純甲醇溶解，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析條件：陽(yáng)離子模式，電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓4 000 V，質(zhì)量掃描范圍(m/z)100～1 100。

以氘代氯仿為溶劑，對(duì)羥基酪醇油酸酯進(jìn)行溶解，然后進(jìn)行1H NMR和13C NMR分析，分析時(shí)采用400 MHz掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 羥基酪醇油酸酯制備的單因素試驗(yàn)

2.1.1 脂肪酶的選擇

脂肪酶是催化甘油三酯進(jìn)行水解和重新酯化的一類生物酶，不同來(lái)源的脂肪酶區(qū)域選擇性不同，催化效率也不同。在醇酸摩爾比1∶2(羥基酪醇500 mg，油酸質(zhì)量1.832 g)、脂肪酶添加量2%、2-甲基-2-丁醇用量2 mL、反應(yīng)溫度分別為37℃和50℃條件下，考察5種不同脂肪酶(Novozym 435、Lipozyme TL IM、Novozym 40086、LS-20和PPL)對(duì)羥基酪醇酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同脂肪酶對(duì)羥基酪醇酯化反應(yīng)的影響

從圖2可以看出，Novozym 435和LS-20在37℃和50℃時(shí)均表現(xiàn)出較高的催化活性，Lipozyme TL IM和PPL均表現(xiàn)出較低的催化活性，而Novozym 40086在37℃時(shí)表現(xiàn)出較高的催化活性，在50℃時(shí)則表現(xiàn)出較低的催化活性。在反應(yīng)時(shí)間12 h條件下，對(duì)比了5種脂肪酶對(duì)羥基酪醇酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見表2。

表2 反應(yīng)12 h不同脂肪酶對(duì)羥基酪醇轉(zhuǎn)化率的影響

由表2可見：在37℃時(shí)Novozym 435催化效率最高，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到78.32%；在50℃時(shí)LS-20 催化效率最高，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到76.90%；當(dāng)無(wú)脂肪酶作為催化劑時(shí)，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率為0，說(shuō)明在該反應(yīng)體系中無(wú)催化劑作用反應(yīng)是很難進(jìn)行的。Novozym 435在37℃和50℃反應(yīng)12 h的羥基酪醇轉(zhuǎn)化率變化很小，說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下溫度對(duì)Novozym 435影響不大。綜合考慮，在后續(xù)的試驗(yàn)中，選擇Novozym 435在37℃條件下進(jìn)行反應(yīng)。

2.1.2 溶劑用量的影響

在醇酸摩爾比1∶2(羥基酪醇500 mg，油酸1.832 g)、脂肪酶添加量2%、反應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間12 h條件下，考察2-甲基-2-丁醇用量對(duì)羥基酪醇酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖3。

注：不同字母表示有顯著性差異(p<0.05);下同

由圖3可見，當(dāng)溶劑用量從2 mL增加至10 mL時(shí)，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率逐漸降低，可能是因?yàn)槿軇┻^(guò)多會(huì)降低羥基酪醇和油酸的濃度，從而減少底物分子間的碰撞概率，導(dǎo)致羥基酪醇轉(zhuǎn)化率下降。當(dāng)溶劑用量為2 mL時(shí)，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率高達(dá)76.39%。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不加溶劑時(shí)，整個(gè)反應(yīng)體系無(wú)法混勻，反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行，這說(shuō)明適量的溶劑有利于脂肪酶催化該反應(yīng)體系。因此，選擇2-甲基-2-丁醇用量為2 mL。

2.1.3 醇酸摩爾比的影響

在羥基酪醇500 mg、脂肪酶添加量2%、2-甲基-2-丁醇用量2 mL、反應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間12 h條件下，考察醇酸摩爾比對(duì)羥基酪醇酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 醇酸摩爾比對(duì)羥基酪醇酯化反應(yīng)的影響

由圖4可見，在醇酸摩爾比為1∶1和1∶1.5時(shí)，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率分別為38%和35%左右，當(dāng)醇酸摩爾比為1∶2.5時(shí)，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率高達(dá)81.39%，當(dāng)醇酸摩爾比為1∶3時(shí)，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率降低。這是因?yàn)轷セ磻?yīng)是可逆反應(yīng)，需要添加過(guò)量的脂肪酸使化學(xué)平衡向正方向進(jìn)行，從而提高羥基酪醇轉(zhuǎn)化率。但是，過(guò)高的油酸用量會(huì)減少羥基酪醇上的羥基與脂肪酶活性中心接觸的機(jī)會(huì)。因此，選擇醇酸摩爾比為1∶2.5。

2.1.4 脂肪酶添加量的影響

在醇酸摩爾比1∶2.5(羥基酪醇500 mg，油酸2.290 g)、2-甲基-2-丁醇用量2 mL、反應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間12 h條件下，考察脂肪酶添加量對(duì)羥基酪醇酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 脂肪酶添加量對(duì)羥基酪醇酯化反應(yīng)的影響

由圖5可見，在脂肪酶添加量為0.5%時(shí)，催化效率是最低的，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率僅有60.47%。隨著脂肪酶添加量的增加，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率逐漸增加，在脂肪酶添加量為2%時(shí)達(dá)到最高，為83.15%，當(dāng)脂肪酶添加量從2%增加至10%時(shí)，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率開始下降。脂肪酶添加量太少，酶活力不夠，催化效率比較低；脂肪酶添加量過(guò)多，整個(gè)反應(yīng)體系的黏度增大，脂肪酶活性位點(diǎn)與底物不能充分接觸，導(dǎo)致羥基酪醇轉(zhuǎn)化率降低。綜合考慮，選擇脂肪酶添加量為2%。

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間的影響

在醇酸摩爾比1∶2.5(羥基酪醇500 mg，油酸2.290 g)、脂肪酶添加量2%、2-甲基-2-丁醇用量2 mL、反應(yīng)溫度37℃條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)羥基酪醇酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)羥基酪醇酯化反應(yīng)的影響

由圖6可以看出，在反應(yīng)時(shí)間0～5 h內(nèi)，羥基酪醇轉(zhuǎn)化率迅速升高，在反應(yīng)時(shí)間7 h后變化較小。因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為7 h。

2.2 羥基酪醇油酸酯制備的響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，在Novozym 435為催化劑、反應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間7 h條件下，以醇酸摩爾比、溶劑用量、脂肪酶添加量為因素，以羥基酪醇轉(zhuǎn)化率(Y)為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)羥基酪醇油酸酯的合成條件進(jìn)行優(yōu)化。Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平見表3，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平

利用Design Expert軟件，對(duì)表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，獲得二次多項(xiàng)回歸方程：Y=82.75+28.14A+6.31B+4.89C+6.63AB+0.23AC-1.97BC-46.54A2-8.72B2-7.42C2。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表5 方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖7是通過(guò)二次回歸模型擬合的各因素之間交互作用的響應(yīng)面分析圖。

圖7 各兩因素交互影響羥基酪醇轉(zhuǎn)化率的響應(yīng)面圖

響應(yīng)面圖的曲面越陡峭，兩兩因素的交互作用就越明顯，相反，響應(yīng)面圖的曲面越平緩，兩兩因素的交互作用就越不顯著。當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形時(shí)表示兩因素交互作用不明顯，而呈橢圓形或馬鞍形時(shí)則表示兩因素交互作用顯著。由圖7可知：各圖均開口向下，凸形曲面，都存在極值；交互項(xiàng)AB(溶劑用量和醇酸摩爾比)影響顯著(p<0.05)，AC(溶劑用量和脂肪酶添加量)、BC(醇酸摩爾比和脂肪酶添加量)影響不顯著(p>0.05)；醇酸摩爾比對(duì)羥基酪醇轉(zhuǎn)化率的影響小于溶劑用量，脂肪酶添加量對(duì)羥基酪醇轉(zhuǎn)化率的影響小于溶劑用量、醇酸摩爾比，因此各因素對(duì)羥基酪醇轉(zhuǎn)化率的影響大小依次為A(溶劑用量)>B(醇酸摩爾比)>C(脂肪酶添加量)，該結(jié)果與方差分析結(jié)果相同，證明了模型可靠性高。

2.2.3 最佳工藝條件確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以得到理論最佳工藝條件為醇酸摩爾比1∶2.671、溶劑用量2.584 mL、脂肪酶添加量2.247%，此時(shí)羥基酪醇理論轉(zhuǎn)化率為91.8%。結(jié)合實(shí)際操作的方便性，將最佳工藝條件修正為醇酸摩爾比1∶2.7(羥基酪醇500 mg，油酸2.474 g)、溶劑用量2.6 mL、脂肪酶添加量2.2%，在此條件下羥基酪醇實(shí)際轉(zhuǎn)化率達(dá)到89.6%。

2.3 羥基酪醇油酸酯的純化

按1.2.2方法對(duì)最佳條件下合成的羥基酪醇油酸酯粗品進(jìn)行純化。經(jīng)測(cè)定，羥基酪醇油酸酯粗品中羥基酪醇含量為43.95 mg/mL，純化后羥基酪醇含量?jī)H為79.67 μg/mL，說(shuō)明純化產(chǎn)品中羥基酪醇含量可以忽略不計(jì)。

2.4 羥基酪醇油酸酯的表征

2.4.1 質(zhì)譜分析

對(duì)純化的羥基酪醇油酸酯進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到羥基酪醇油酸酯的質(zhì)譜圖，見圖8。

圖8 羥基酪醇油酸酯的質(zhì)譜圖

由圖8可知，羥基酪醇油酸酯m/z為439，與推測(cè)的產(chǎn)物一致，其分子式為C26H42O4。

2.4.2 核磁分析

對(duì)純化的羥基酪醇油酸酯進(jìn)行1H NMR和13C NMR分析。1H NMR(400 MHz，CDCl3)結(jié)果:δ6.76(1H,d,H-2′)，δ6.67(1H,d,H-5′)，δ6.59(1H,dd,H-1′)，δ5.35(2H,m,H-9和H-10)，δ4.20(2H,t,H-8′)，δ2.78(2H,t,H-7′)，δ2.29(2H,t,H-2)，δ2.04(4H,m,H-8和H-11)，δ1.54(2H,m,H-3)，δ1.28(4H,m,H-7和H-12)，δ1.23(14H,m,H-4～H-6和H-13～H-16)，δ1.22(2H,m,H-17)，δ0.94(3H,t,H-18)。13C NMR(101 MHz，CDCl3)結(jié)果：δ130.02、144.21、142.84、174.22(C，C-6′，C-4′，C-3′和C-1)，δ129.89(CH，C-9/C-10)，δ116.29、115.80、120.87(CH，C-5′，C-2′和C-1′)，δ65.11(CH2，C-8′)，δ34.43(CH2，C-7′)，δ34.34(CH2，C-2)，δ32.55(CH2，C-16)，δ29.78(CH2，C-7/C-12)，δ29.35～29.64(CH2，C-4～C-6/C-13～C-15)，δ27.23(CH2，C-8/C-11)，δ25.35(CH2，C-3)，δ22.68(CH2，C-17)和δ14.10(CH3，C-18)。核磁分析結(jié)果說(shuō)明，成功合成了羥基酪醇油酸酯。

3 結(jié) 論

本研究利用脂肪酶Novozym 435催化羥基酪醇與油酸酯化，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化確定了合成羥基酪醇油酸酯的最佳工藝條件，在最佳條件下羥基酪醇轉(zhuǎn)化率為89.6%。質(zhì)譜和核磁分析表明，成功合成了羥基酪醇油酸酯。本研究為有效解決橄欖油加工過(guò)程中油橄欖果水、渣中羥基酪醇的高值利用，提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支撐。