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      飼糧中添加丙酮酸肌酸對(duì)錦江牛體外發(fā)酵特性的影響

      2022-08-04 05:09:22張?zhí)諠?/span>李艷嬌盧顧偉瞿明仁趙向輝邱清華歐陽克蕙
      飼料工業(yè) 2022年14期
      關(guān)鍵詞:肌酸丙酮酸胃液

      ■毛 康 張?zhí)諠?李艷嬌 盧顧偉 瞿明仁 趙向輝 邱清華 歐陽克蕙

      (江西省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),江西農(nóng)業(yè)大學(xué),江西 南昌 330045)

      瘤胃是反芻動(dòng)物區(qū)別其他單胃動(dòng)物最顯著的特征,瘤胃發(fā)酵功能的好壞直接影響反芻動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能。因此如何正確科學(xué)地調(diào)控瘤胃發(fā)酵功能,一直是反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的關(guān)鍵。丙酮酸肌酸(creatine pyruvate,CrPyr)是一種新型的功能營(yíng)養(yǎng)素,具有肌酸的特性和丙酮酸的功能,其中肌酸的含量占60%,丙酮酸的含量占40%[1]。肌酸是能量代謝和蛋白質(zhì)代謝過程中重要的含氮化合物之一。在過去幾十年里,肌酸被廣泛運(yùn)用于反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)當(dāng)中,作為氮的補(bǔ)充劑。有研究表明,瘤胃細(xì)菌產(chǎn)生的肌酸酶將肌酸降解為尿素和肌氨酸,然后在尿素酶的作用下將尿素催化為CO2和NH3[2]。丙酮酸是能量轉(zhuǎn)化過程中重要的代謝產(chǎn)物[3]。對(duì)于反芻動(dòng)物而言,丙酮酸還是瘤胃微生物在對(duì)碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵后的一個(gè)重要中間產(chǎn)物[4],瘤胃內(nèi)丙酮酸在轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids,VFA)的過程中所釋放的ATP 又可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。在前期的研究中,山羊日糧中添加丙酮酸鈣可以提高瘤胃VFA的含量,降低日糧中蛋白質(zhì)的降解,并降低瘤胃氨態(tài)氮(ammonia nitrogen,NH3-N)濃度[5]。CrPyr 可以給機(jī)體提供丙酮酸和肌酸兩種代謝產(chǎn)物[6],可以推測(cè)CrPyr能夠同時(shí)促進(jìn)瘤胃能量代謝和氮的供應(yīng),促進(jìn)瘤胃發(fā)酵功能。目前關(guān)于飼糧中添加CrPyr對(duì)肉牛體外瘤胃發(fā)酵的影響在國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道,因此,本試驗(yàn)旨在通過體外人工瘤胃發(fā)酵方法,探討CrPyr對(duì)體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響,為CrPyr在反芻動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      1.1.1 CrPyr

      CrPyr 購(gòu)買于上海津力藥業(yè)股份有限公司,其中肌酸含量≥58.0%,丙酮酸含量≥30.0%。

      1.1.2 發(fā)酵底物

      發(fā)酵底物由粗料稻草,精料玉米、豆粕、麥麩等組成,將飼料原料充分粉碎后,按照精粗比2∶8進(jìn)行混勻配制,發(fā)酵底物混勻之后放在65 ℃烘箱當(dāng)中烘干備用。

      1.1.3 緩沖液的配制

      按順序添加520.2 mL 純化水+208.1 mL 緩沖液(B)+208.1 mL常量元素溶液(C)+ 0.1 mL微量元素溶液(A)+1.0 mL 刃天青溶液(D)+62.4 mL 還原液(E),通入CO2,直至溶液由淡藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色。調(diào)整成人工唾液的A、B、C、D、E配方見表1。

      表1 人工唾液的組成成分

      1.1.4 瘤胃液供體動(dòng)物及其飼養(yǎng)管理

      選取3 頭健康狀況良好的錦江公牛,體重300~350 kg,每天飼喂兩次(6:00 和18:00),自由飲水。基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

      表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

      1.1.5 瘤胃液的采集

      于下午采食前,首先用牛鼻鉗固定牛頭,接著使用胃管式瘤胃液采集器采集瘤胃液,去除最初的50 mL瘤胃液(避免唾液的影響),然后將收集到的瘤胃液迅速裝入充滿CO2且經(jīng)過滅菌處理的保溫瓶中,收集完畢,蓋上保溫瓶蓋,帶回實(shí)驗(yàn)室。將4 層紗布過濾后的瘤胃液通入CO2氣體5 min,并向預(yù)先充滿CO2且加好發(fā)酵底物的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分別加入20 mL 瘤胃液和40 mL 人工唾液。連接好培養(yǎng)瓶和注射器后打開通氣閥和振蕩開關(guān),培養(yǎng)開始。

      1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

      試驗(yàn)采取單因素設(shè)計(jì),共設(shè)6 個(gè)組(分別添加0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、3.2%的CrPyr),設(shè)3個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)分別為0、12 h和24 h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有4個(gè)重復(fù)。

      1.3 指標(biāo)的測(cè)定

      發(fā)酵0、12、24 h,將對(duì)應(yīng)的發(fā)酵瓶放置冰盒中30 min,終止發(fā)酵。隨后測(cè)定發(fā)酵液的pH,接著發(fā)酵液用尼龍網(wǎng)布進(jìn)行過濾,過濾好的瘤胃液分裝到10 mL離心管,然后放入-20 ℃的冰箱中保存,用于測(cè)定瘤胃發(fā)酵參數(shù):NH3-N、微生物粗蛋白(microbial crude protein, MCP)、VFA以及丙酮酸和肌酸的含量。尼龍網(wǎng)布中的殘?jiān)M(jìn)行回收,65 ℃的烘箱中烘干,用于測(cè)定干物質(zhì)的消化率。

      1.3.1 pH的測(cè)定

      發(fā)酵液的pH 采用上海雷磁PHS-3C 型pH 計(jì)進(jìn)行測(cè)定,在測(cè)定之前使用pH 4.01和pH 6.80的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液進(jìn)行校正。

      1.3.2 NH3-N的測(cè)定

      參考馮宗慈等[7]利用比色法測(cè)定發(fā)酵液中NH3-N的含量。

      1.3.3 MCP的測(cè)定

      MCP 采用考馬斯亮藍(lán)法[8],使用752 紫外可見分光光度計(jì)來測(cè)定。

      1.3.4 VFA的測(cè)定采用GC-1690氣相色譜儀(杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司)FID 檢驗(yàn)器測(cè)定VFA,色譜柱:Nukol 毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度220 ℃;檢測(cè)器溫度250 ℃;柱溫升溫程序:起始溫度60 ℃,然后以20 ℃/min的升溫速率升至190 ℃,保持3 min;進(jìn)樣口壓力:100 kPa;SPL分流比:20∶1;氣體流速:載氣氮?dú)猓∟2)75 mL/min,氫氣(H2)70 mL/min,空氣50 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL。

      1.3.5 干物質(zhì)消化率

      式中:M1——發(fā)酵前底物重(g);

      M2——發(fā)酵后殘?jiān)兀╣)。

      1.3.6 丙酮酸的測(cè)定

      丙酮酸使用丙酮酸試劑盒進(jìn)行測(cè)定,試劑盒購(gòu)買于南京建成生物工程研究所。

      式中:M3——發(fā)酵前丙酮酸的含量(μmol/mL);

      M4——發(fā)酵后丙酮酸的含量(μmol/mL)。

      1.3.7 肌酸的測(cè)定

      肌酸使用比色法進(jìn)行測(cè)定[9]。肌酸可在堿性條件下與聯(lián)乙酰-α萘酚發(fā)生反應(yīng),生成紅色產(chǎn)物,在520 nm形成吸收峰。

      式中:M5——發(fā)酵前肌酸的含量(mg/L);

      M6——發(fā)酵后肌酸的含量(mg/L)。

      1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

      試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件進(jìn)行初步整理,統(tǒng)計(jì)結(jié)果使用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析,用Duncan’s法進(jìn)行多重比較,使用GraphPad Prism 6.01繪圖。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 CrPyr 對(duì)瘤胃體外發(fā)酵pH、NH3-N、MCP、干物質(zhì)表觀消化率的影響(見表3、圖1)

      由表3 可知,發(fā)酵0 h 和12 h,添加不同劑量的CrPyr 對(duì)瘤胃液pH 無顯著影響,但發(fā)酵24 h,添加組的pH呈現(xiàn)二次下降后上升的趨勢(shì),1.6%組的pH顯著低于對(duì)照組(P<0.05),但處在正常水平。發(fā)酵0 h,添加CrPyr對(duì)NH3-N無顯著影響;發(fā)酵12 h,1.6%組和3.2%組的NH3-N濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05);發(fā)酵24 h,3.2%組的NH3-N濃度極顯著高于其余各組(P<0.01)。發(fā)酵0 h,不同CrPyr 添加量對(duì)MCP 的濃度無顯著影響;發(fā)酵12 h,1.6%組顯著降低了MCP 的含量(P<0.05),但發(fā)酵24 h 之后添加組MCP 的含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在發(fā)酵過程中添加CrPyr對(duì)干物質(zhì)表觀消化率無顯著影響。由圖1可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),各添加組NH3-N的濃度呈現(xiàn)先顯著性地下降后顯著性地升高的變化趨勢(shì)(P<0.05);與0 h相比,發(fā)酵12 h,1.2%組的MCP 濃度顯著性增加(P<0.05),其余各添加量組的MCP 濃度無顯著性變化,但發(fā)酵24 h后,各組MCP的濃度顯著性升高(P<0.05)。

      圖1 添加不同劑量的CrPyr在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)NH3-N和MCP的影響

      表3 CrPyr對(duì)肉牛體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)和干物質(zhì)表觀消化率的影響

      2.2 CrPyr對(duì)發(fā)酵液中VFA含量的影響(見表4、圖2)

      由表4可知,發(fā)酵0 h,添加組的總揮發(fā)性脂肪酸(Total VFA,TVFA)與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05);發(fā)酵12 h,0.4%組的TVFA、乙酸和異戊酸的濃度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01);但與1.6%組相比,0.4%組的丙酸和異丁酸的濃度顯著升高(P<0.05)、丁酸的濃度極顯著升高(P<0.01)。發(fā)酵24 h,1.6%組的TVFA、乙酸和異戊酸濃度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),異丁酸濃度顯著高于其余各組(P<0.05);發(fā)酵0 h和24 h,3.2%組的乙酸/丙酸值極顯著高于其余各組(P<0.01)。由圖2可知,與發(fā)酵0 h相比,各組中乙酸、丙酸和TVFA的濃度在發(fā)酵12 h均顯著性增加(P<0.05),但發(fā)酵24 h之后,1.6%組的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和TVFA的濃度以及3.2%組的戊酸和異戊酸的濃度均顯著高于發(fā)酵12 h(P<0.05)。而乙酸/丙酸值在發(fā)酵12 h時(shí)與對(duì)照組相比顯著下降(P<0.05),但其比值在發(fā)酵24 h之后與12 h相比無顯著性變化(P>0.05)。

      圖2 添加不同劑量的CrPyr在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)VFA的影響

      表4 CrPyr對(duì)發(fā)酵液中VFA含量的影響

      2.3 CrPyr 對(duì)發(fā)酵液中丙酮酸和肌酸含量的影響(見表5、圖3)

      由表5可知,發(fā)酵0 h,1.2%、1.6%、3.2%組發(fā)酵液中丙酮酸濃度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01);發(fā)酵12 h,各組之間的丙酮酸濃度無顯著性差異(P>0.05),但發(fā)酵24 h后,與其余各組相比,1.2%組的丙酮酸濃度最低,3.2%組丙酮酸濃度極顯著高于其余各組(P<0.01)。發(fā)酵0、12 h和24 h,1.2%、1.6%和3.2%組中肌酸濃度均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),且隨著添加量的增加肌酸濃度呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。由圖3可知,與發(fā)酵0 h 相比,發(fā)酵12 h 之后,0.8%、1.2%、1.6%和3.2%添加組的丙酮酸濃度顯著性下降(P<0.05),但對(duì)照組和0.4%添加組丙酮酸的含量無顯著性變化,并且發(fā)酵24 h之后各組丙酮酸的濃度與發(fā)酵12 h相比,均無顯著性差異;與發(fā)酵0 h相比,各組肌酸的濃度在發(fā)酵12 h 后均無顯著性差異,但在發(fā)酵24 h 之后,1.2%、1.6%和3.2%添加組肌酸的濃度顯著低于發(fā)酵12 h的濃度(P<0.05)。

      圖3 添加不同劑量的CrPyr在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)丙酮酸和肌酸含量的影響

      表5 CrPyr對(duì)發(fā)酵液中丙酮酸和肌酸含量的影響

      3 討論

      3.1 CrPyr對(duì)體外培養(yǎng)發(fā)酵液pH、干物質(zhì)表觀消化率的影響

      瘤胃液pH 反映瘤胃的代謝狀態(tài),是食糜中VFA與唾液緩沖液相互作用、瘤胃上皮對(duì)VFA吸收及食糜流出等綜合作用的結(jié)果[10]。因本試驗(yàn)是體外發(fā)酵,只有微生物對(duì)底物的發(fā)酵產(chǎn)生VFA的積累,從而造成對(duì)pH 的影響。pH 過高和過低都會(huì)影響瘤胃微生物的發(fā)酵。研究表明瘤胃內(nèi)正常pH的范圍是6~7[11],本試驗(yàn)中各組的pH 均處在這個(gè)范圍之內(nèi),表明人工瘤胃在試驗(yàn)中處于正常的發(fā)酵狀態(tài),并且在發(fā)酵24 h 后,添加組pH 低于對(duì)照組,其原因可能是添加不同水平的CrPyr 提高了瘤胃內(nèi)VFA 的含量,從而降低了瘤胃pH。干物質(zhì)降解率反映了飼料原料被消化利用的難易程度,也可以體現(xiàn)飼用價(jià)值的高低以及被微生物和機(jī)體組織所利用的程度[12-13],本試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵12 h和24 h,隨著CrPyr添加量的提高,干物質(zhì)表觀消化率在數(shù)值上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),表明低濃度CrPyr添加量在一定程度上能夠促進(jìn)干物質(zhì)消化,但濃度過高抑制干物質(zhì)消化。其原因可能是CrPyr在瘤胃當(dāng)中分解為丙酮酸和肌酸,丙酮酸是能量轉(zhuǎn)化過程中重要的代謝產(chǎn)物[3],在瘤胃中直接作為VFA合成的前體物質(zhì),CrPyr添加量過高可能降低了瘤胃微生物對(duì)碳水化合物的依賴。

      3.2 CrPyr對(duì)體外培養(yǎng)發(fā)酵液丙酮酸、肌酸、NH3-N和MCP的影響

      丙酮酸和肌酸都是能量代謝和蛋白質(zhì)代謝的重要中間產(chǎn)物。丙酮酸在轉(zhuǎn)化成VFA 的時(shí)候釋放ATP可以促進(jìn)瘤胃微生物的生長(zhǎng),肌酸在瘤胃中的適應(yīng)性取決于氨的緩慢釋放,可以為MCP 合成提供直接原料。有研究表明,CrPyr 可以給機(jī)體提供丙酮酸和肌酸兩種代謝產(chǎn)物[14]。本試驗(yàn)中,發(fā)酵0 h和24 h,3.2%組的丙酮酸含量極顯著高于其余各組,并且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),瘤胃液中丙酮酸的含量呈現(xiàn)一個(gè)先顯著性下降后保持平穩(wěn)的趨勢(shì),表明發(fā)酵液中丙酮酸的降解是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,因?yàn)樘砑覥rPyr,導(dǎo)致發(fā)酵液中丙酮酸的含量增加,使瘤胃微生物可以充分利用丙酮酸,所以此時(shí)丙酮酸的消耗速率大于生成速率,并且丙酮酸的消耗速率與CrPyr 的添加量呈線性關(guān)系。12 h 之后,隨著添加的丙酮酸含量降低,瘤胃中生成丙酮酸的速率與消耗速率趨于平衡。發(fā)酵0、12、24 h,1.2%、1.6%和3.2%組的肌酸含量極顯著高于對(duì)照組,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),肌酸含量呈現(xiàn)一個(gè)先保持平穩(wěn)后顯著性下降的變化過程,并且肌酸的消耗量與CrPyr的添加量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系。分析其原因可能是剛開始丙酮酸的大量存在減緩了肌酸的消耗。

      NH3-N是瘤胃內(nèi)肽、氨基酸、蛋白質(zhì)、尿素和其他非蛋白氮共同分解的最終產(chǎn)物,也是瘤胃微生物合成MCP 的主要原料。瘤胃內(nèi)的最佳NH3-N 的含量在0.35~29.00 mg/dL[15]。有研究表明肌酸在瘤胃的降解分為兩步,第一步是瘤胃細(xì)菌產(chǎn)生肌酸酶使肌酸降解為尿素和肌氨酸,第二步是在尿素酶的作用下催化生成CO2和NH3[2]。本試驗(yàn)NH3-N 的含量均處在正常的范圍。發(fā)酵12 h 和24 h,隨著添加量的增加,其含量均高于對(duì)照組,其原因可能是肌酸的降解導(dǎo)致。由肌酸含量的變化可以看出,在發(fā)酵24 h后肌酸的含量顯著性低于0 h,說明肌酸在這個(gè)時(shí)間段被降解生成氨,從而增加了處理組NH3-N在發(fā)酵24 h的濃度。

      MCP是反芻動(dòng)物最主要的蛋白質(zhì)來源,其含量的高低取決于瘤胃中碳源和氮源的比例是否適宜。本試驗(yàn)發(fā)酵24 h添加組的NH3-N和MCP的含量均高于對(duì)照組,且MCP含量變化和NH3-N的變化趨勢(shì)是一致的,均呈現(xiàn)一個(gè)先升高后下降的趨勢(shì),但3.2%組NH3-N的濃度極顯著地增高,而其對(duì)應(yīng)的MCP 的含量又下降,說明過高的CrPyr會(huì)降低MCP的合成,適宜的CrPyr可以有效促進(jìn)NH3-N向MCP轉(zhuǎn)化,這與陳秀霞等[16]的研究結(jié)果相似。其原因可能是CrPyr進(jìn)入瘤胃之后分解為丙酮酸和肌酸兩種單體,肌酸降解提供MCP合成的原料,丙酮酸間接提供MCP 合成所需的能量,從而促進(jìn)瘤胃微生物的活動(dòng),提高了MCP的合成量。

      3.3 CrPyr對(duì)體外培養(yǎng)發(fā)酵液VFA的影響

      VFA 的含量和組成比例是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵方式和發(fā)酵能力的直接指標(biāo),并且是反芻動(dòng)物能量利用的主要形式[17]。而VFA 主要由乙酸、丙酸和丁酸組成,占TVFA 的95%,乙酸有利于動(dòng)物的體脂率和乳脂率提高,丙酸有利于葡萄糖轉(zhuǎn)化和儲(chǔ)存,丁酸可為機(jī)體各組織供能[18]。本試驗(yàn)中,在發(fā)酵24 h,1.6%添加組的TVFA極顯著高于其余各組,而乙酸/丙酸值極顯著低于3.2%添加組,卻與其余組相比無顯著性差異,表明該添加劑量下可以促進(jìn)VFA的生成,并且優(yōu)化VFA的組成,提高能量的利用效率,為MCP的合成提供了碳源,并且分析本試驗(yàn)中隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)pH降低的現(xiàn)象,可能與發(fā)酵液中VFA含量升高有關(guān)。有研究表明,添加能量代謝中間產(chǎn)物蘋果酸可以提高瘤胃體外發(fā)酵VFA的濃度,改善瘤胃發(fā)酵能力[19],與本試驗(yàn)結(jié)果相似。然而張荃[10]在山羊飼糧中添加丙酮酸鈣,可以造成瘤胃液中乙酸的比例下降、丙酸和丁酸的比例上升,與本試驗(yàn)的結(jié)果有差異。分析其原因可能是添加量的不同造成的。

      4 結(jié)論

      ①丙酮酸在12 h 內(nèi)降解的速率較快,而肌酸在12 h 之后才開始快速降解,丙酮酸的降解率隨著CrPyr添加量的提高而增加,相反,肌酸的降解率隨著CrPyr添加量的提高而降低。

      ②飼糧中添加CrPyr 可以提高發(fā)酵液中MCP、NH3-N 和VFA 的濃度,改善瘤胃內(nèi)環(huán)境,本試驗(yàn)條件下1.6%的CrPyr添加效果最好。

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