月桂酰精氨酸乙酯的抗菌活性及對(duì)牦牛鮮肉腸貯藏品質(zhì)的影響

彭美玲，郝剛*，唐善虎，李思寧，蔡寅川

(1.西南民族大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.四川阿壩州工業(yè)經(jīng)濟(jì)研究所，四川 汶川 623000)

月桂酰精氨酸乙酯(lauroyl arginine ethyl ester，LAE)是一種新型食品保鮮劑，在不同基質(zhì)食品中的抗菌性能有差別[1]。LAE在體內(nèi)可分解為月桂酸和精氨酸乙酯，安全性較好[2-3]。LAE對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母均有抑菌作用[4]。2005年，美國(guó)FDA將LAE列為一般公認(rèn)(Generally Recognized as Safe，GRAS)的食品添加劑，可添加到畜、禽肉類(lèi)食品中[5]。2007年，歐洲食品安全管理局(EFSA)批準(zhǔn)了LAE的食品安全認(rèn)證[6]。根據(jù)衛(wèi)健委《食品添加劑新品種管理辦法》相關(guān)規(guī)定，2018年，我國(guó)國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心發(fā)布了關(guān)于食品添加劑LAE的征求意見(jiàn)，內(nèi)容中規(guī)定了LAE用于新鮮果蔬的最大添加量為200 mg/kg[7]。LAE可通過(guò)直接添加或制成包裝薄膜的方式應(yīng)用于肉制品、乳制品、果蔬產(chǎn)品的保鮮[8-10]。LAE可與其他水溶性保鮮劑復(fù)配以提高其保鮮能力[11-13]。有報(bào)道表明LAE與山梨酸鉀有協(xié)同抗菌作用，LAE與山梨酸鉀復(fù)配能夠抑制榨菜中微生物增殖1～2個(gè)數(shù)量級(jí)[14]。將LAE、尼泊金和殼聚糖復(fù)配用于青椒的防腐保鮮，結(jié)果顯示其對(duì)青椒具有顯著的保鮮效果[15]。因牦牛生活在高海拔、低氧濃度的高寒極端環(huán)境，牦牛肉形成了獨(dú)特的肉品品質(zhì)，具有高蛋白、富含多種氨基酸、低脂肪的特質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[16]，但牦牛肉制品在貯藏過(guò)程中容易受到微生物污染導(dǎo)致變質(zhì)[17]，因此，探究牦牛肉的保鮮方法顯得尤為必要。目前國(guó)內(nèi)外研究肉類(lèi)保鮮的方法諸多[18]，添加保鮮劑是其中之一。殼聚糖(chitosan, CS)與乳酸鏈球菌素(Nisin)是抗菌保鮮效果顯著且生物相容性較好的天然食品保鮮劑[19]。本文研究了月桂酰精氨酸乙酯的抑菌活性以及將月桂酰精氨酸乙酯、殼聚糖和乳酸鏈球菌素復(fù)配用于牦牛鮮肉腸的保鮮，考察其對(duì)牦牛鮮肉腸貯藏品質(zhì)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豬肥膘：購(gòu)于成都正規(guī)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；體質(zhì)健壯的3歲齡公牦牛背最長(zhǎng)肌：購(gòu)于四川紅原牦牛肉食品有限公司；食鹽、雞精、五香粉、料酒：購(gòu)于紅旗超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

月桂酰精氨酸乙酯(BR)：成都傲飛生物化學(xué)品有限責(zé)任公司；殼聚糖(食品級(jí))：深圳市星牧生物工程有限公司；乳酸鏈球菌素(食品級(jí))：山東元泰生物工程有限公司；石油醚(沸程30～60 ℃)、無(wú)水乙醇、酚酞、氫氧化鉀、三氯乙酸(TCA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)、酚酞、氯仿、氯化鈉(AR)、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉、馬鈴薯培養(yǎng)基(BR)：成都科隆化學(xué)品有限公司；多聚甲醛(AR)：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)菌株：綠膿桿菌(PeseudomonasaeruginosaCMCC10104)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCMCC63501)、英諾克李斯特菌(ListeriainnocuaATCC33090)、白假絲酵母(CandidaalbicansATCC10231)、黑曲霉(AspergillusnigerCMCC98003)：購(gòu)于海博生物技術(shù)有限公司；鼠傷寒沙門(mén)氏菌(SalmonellatyphimuriumATCC14028)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureussubsp. ATCC29213)、弗氏檸檬酸桿菌(CitrobacterfreundiiATCC51459)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC51459)：由本校動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BSA224S-CW型電子天平 賽多利斯儀器有限公司；WF32型色差儀 深圳威孚光電科技有限公司；XR53648型電熱恒溫水浴鍋 金壇區(qū)西城新瑞有限公司；UV1810S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；5810R型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZWY-2102C型恒溫振蕩培養(yǎng)器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 牦牛鮮肉腸的制作

將原料(牦牛肉∶豬肥膘為7∶3)、輔料(原料以100%計(jì)，食鹽3.5%，雞精0.4%，五香粉0.5%，料酒1.0%)充分混勻，置于4 ℃冰箱中腌制24 h，分別將LAE各保鮮組分混入腌制完畢的牦牛肉中混合均勻后攪碎，灌裝成長(zhǎng)度約為5 cm的腸體，用排氣針扎眼排除腸內(nèi)氣體后置于4 ℃冰箱中貯藏，于第1，3，6，9，12，15天測(cè)定指標(biāo)，各實(shí)驗(yàn)處理組如下：

對(duì)照組：將牦牛肉、豬肥膘與輔料充分混勻后灌腸，不添加保鮮劑。

低濃度LAE組：將牦牛肉、豬肥膘與輔料再加入0.1 g/kg LAE，混勻后灌腸。

高濃度LAE組：將牦牛肉、豬肥膘、輔料再加入0.3 g/kg LAE，混勻后灌腸。

LAE+Nisin組：將牦牛肉、豬肥膘、輔料再加入0.2 g/kg LAE+0.3 g/kg Nisin，混勻后灌腸。

LAE+CS組：將牦牛肉、豬肥膘、輔料再加入0.2 g/kg LAE+5 g/kg CS，混勻后灌腸。

LAE+Nisin+CS組：將牦牛肉、豬肥膘、輔料再加入0.2 g/kg LAE+0.3 g/kg Nisin+5 g/kg CS，混勻后灌腸。

1.4.2 LAE的抗菌活性測(cè)定

1.4.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)

將用平板活化后的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，11000 r/min離心5 min棄上清液，加入無(wú)菌生理鹽水清洗1次后再以11000 r/min離心5 min棄上清液，沉淀用LB液體培養(yǎng)基稀釋為1×108CFU/mL作為待測(cè)菌液。

1.4.2.2 真菌的培養(yǎng)

取經(jīng)平板活化的真菌轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，11000 r/min離心5 min棄上清液，加入無(wú)菌生理鹽水清洗1次后再以11000 r/min離心5 min棄上清液，沉淀用PDA液體培養(yǎng)基稀釋為4×104CFU/mL作為待測(cè)菌液。

1.4.2.3 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)測(cè)定法

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌和真菌的待測(cè)菌液分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入100 μL待測(cè)菌液，隨后加入經(jīng)倍比稀釋的LAE溶液100 μL，LAE的濃度分別為4，8，16，32，64，128 μg/mL，以多聚甲醛為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水為陰性對(duì)照。細(xì)菌置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，每隔0.5 h用酶標(biāo)儀測(cè)630 nm處的吸光值。真菌置于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，每隔0.5 h用酶標(biāo)儀測(cè)630 nm處的吸光值，吸光值與初始值相比，沒(méi)有顯著變化的最小LAE濃度為L(zhǎng)AE對(duì)該菌的最低抑菌濃度。

按最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定法測(cè)定LAE對(duì)英諾克李斯特菌等革蘭氏陽(yáng)性菌、綠膿桿菌等革蘭氏陰性菌、白色念珠菌等真菌的抗菌活性。

1.4.3 酸價(jià)的測(cè)定

參考GB 5009.229-2016《食品中酸價(jià)的測(cè)定》測(cè)定牦牛鮮肉腸的酸價(jià)。

1.4.4 色度的測(cè)定

將牦牛肉腸橫切成1 cm高的圓柱體，用色差計(jì)測(cè)定肉腸切面的亮度值L*、紅綠值a*、黃藍(lán)值b*，每個(gè)樣品測(cè)定3次取平均值，儀器使用前用標(biāo)準(zhǔn)板校正[20]。

1.4.5 硫代巴比妥酸值(TBA)的測(cè)定

參考GB 5009.181-2016《食品中丙二醛的測(cè)定》方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 持水性測(cè)定

參考儀淑敏等[21]的方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAE的抗菌活性檢測(cè)

采用MIC法考察了LAE對(duì)綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、英諾克李斯特菌等微生物的抑菌活性。LAE對(duì)各菌的最低抑菌濃度見(jiàn)表1，對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、英諾克李斯特菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉的MIC分別為32，32，64，32，16，16，8，16，32 μg/mL。LAE對(duì)各種革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌都有顯著的抑制作用，具有廣譜抗菌活性，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌。

表1 最低抑菌濃度(MIC)Table 1 The minimum inhibitory concentration (MIC)

2.2 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中酸價(jià)的變化

酸價(jià)是用來(lái)衡量肉與肉制品酸敗程度的重要指標(biāo)[22]。牦牛鮮肉腸酸價(jià)的變化見(jiàn)圖1。

圖1 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中酸價(jià)的變化

由圖1可知，各處理組在15 d貯藏期內(nèi)的酸價(jià)均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)(P<0.05)，第1天各處理組的酸價(jià)變化差異不顯著(P>0.05)，牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中酸價(jià)逐漸增大的原因一方面是在貯藏過(guò)程中肉腸內(nèi)源性脂肪酶水解脂肪生成游離脂肪酸，另一方面是牦牛肉腸中的脂肪隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，由于熱和微生物的作用而逐漸水解生成游離脂肪酸[23]。對(duì)照組在15 d貯藏期內(nèi)酸價(jià)增加的趨勢(shì)最為顯著(P<0.05)，第15天時(shí)達(dá)1.19 mg/g，LAE對(duì)酸價(jià)的增加有一定的抑制作用，且濃度越大，抑制作用越明顯。LAE+Nisin 與LAE+CS復(fù)配組能協(xié)同抑制由于微生物繁殖導(dǎo)致的酸價(jià)增加，后者的抑制作用更明顯，說(shuō)明LAE+CS協(xié)同抑制酸價(jià)增加的效果優(yōu)于LAE+Nisin復(fù)配。3種保鮮劑復(fù)配時(shí)，第15天時(shí)酸價(jià)增加最小，抑制酸價(jià)增加的效果最強(qiáng)。

2.3 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中色度的變化

2.3.1 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中L*值的變化

肉制品的色澤是影響消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)與否的重要因素，對(duì)肉腸顏色感官評(píng)價(jià)可對(duì)牦牛鮮肉腸的新鮮度進(jìn)行快捷簡(jiǎn)單的評(píng)定。貯藏期間牦牛肉腸的L*值變化見(jiàn)表2。

表2 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中L*值的變化Table 2 Changes of L* values of yak meat sausage during storage

由表2可知，在15 d貯藏期內(nèi)各處理組的L*值總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(P<0.05)，對(duì)照組的下降趨勢(shì)較為明顯，第1天時(shí)各處理組的L*值變化差異不顯著(P>0.05)。添加LAE后肉腸亮度的下降趨勢(shì)略減緩，高濃度LAE和低濃度LAE對(duì)亮度值的影響不大，LAE+Nisin與LAE+CS復(fù)配組在一定程度上可抑制亮度降低，且LAE+CS的復(fù)配效果優(yōu)于LAE+Nisin。LAE+Nisin+CS的復(fù)配效果最好，說(shuō)明LAE與兩種保鮮劑復(fù)配后有較為顯著的護(hù)色作用。

2.3.2 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中a*值的變化

牦牛鮮肉腸貯藏期內(nèi)各處理組的a*值變化見(jiàn)表3。

表3 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中a*值的變化Table 3 Changes of a* values of yak meat sausage during storage

肉色能直觀(guān)反映肉的新鮮程度，a*值越大表示肉色越鮮紅，其變化主要是由于肌紅蛋白(Mb)的幾種存在方式，即鮮紅色氧合態(tài)MbO2、褐紅色氧化態(tài)MMb以及紫紅色還原態(tài)Mb相互轉(zhuǎn)化的速率來(lái)決定的，而MMb還原速率或Mb氧合速率越快，則MbO2的含量越高，肉色越鮮紅，a*值越大。由表3可知，牦牛肉腸在貯藏期內(nèi)各處理組的a*值總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(P<0.05)，第1天和第3天各處理組的a*值變化差異不顯著(P>0.05)，高濃度LAE組的a*值在第15天時(shí)略高于低濃度LAE組，說(shuō)明LAE的濃度對(duì)a*值有一定影響，且濃度越大護(hù)色能力越強(qiáng)。第6天后各組的a*值變化差異顯著(P<0.05)，高濃度LAE組與LAE+Nisin復(fù)配組在第15天時(shí)a*值變化差異不顯著(P>0.05)。第15天時(shí)LAE+Nisin組與LAE+CS組的a*值變化差異顯著，LAE+CS組的a*值高于LAE+Nisin組，說(shuō)明CS的護(hù)色效果明顯優(yōu)于Nisin，3種保鮮劑復(fù)配效果最好，因殼聚糖具有良好的抗氧化效果，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中能顯著延緩血紅蛋白及類(lèi)胡蘿卜素等呈色物質(zhì)氧化，LAE與另外兩種保鮮劑均具有一定抗菌能力，在牦牛肉貯藏過(guò)程中可有效延緩由于微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致的肌肉組織水分流失與結(jié)構(gòu)的損壞[24]。

2.3.3 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中b*值的變化

牦牛鮮肉腸貯藏期內(nèi)各處理組的b*值變化見(jiàn)表4。

表4 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中b*值的變化Table 4 Changes of b* values of yak meat sausage during storage

由表4可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組的b*值呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)(P<0.05)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肉腸會(huì)發(fā)生腐敗，細(xì)菌等微生物在腸體內(nèi)不斷生長(zhǎng)繁殖，部分蛋白被分解，使得肉腸的色澤發(fā)黃、發(fā)綠、發(fā)青并且產(chǎn)生黃光，導(dǎo)致肉腸的a*值逐漸下降，b*值逐漸上升[25]。前3 d各處理組的b*值變化差異不顯著(P>0.05)，第6天后對(duì)照組與其他處理組在各測(cè)定時(shí)間點(diǎn)b*值變化差異顯著(P<0.05)，高濃度LAE組的b*值在第15天時(shí)高于低濃度LAE組，說(shuō)明LAE在一定程度上可以抑制牦牛肉腸b*值的改變，高濃度LAE組與LAE+Nisin組的護(hù)色能力相差不大，LAE+CS組的護(hù)色效果優(yōu)于LAE+Nisin組，這可能與殼聚糖的護(hù)色效果有關(guān)。在15 d貯藏期內(nèi)，對(duì)照組增加的趨勢(shì)最顯著，LAE+Nisin+CS組b*值增加的趨勢(shì)最緩慢，其護(hù)色效果明顯優(yōu)于其他處理組。

2.4 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中硫代巴比妥酸值(TBA)的變化

在冷藏過(guò)程中，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，牦牛鮮肉腸中脂肪的氧化程度過(guò)高，會(huì)產(chǎn)生不愉快的氣味，影響肉腸的品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[26]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，牦牛肉腸中不飽和脂肪酸會(huì)逐漸氧化形成丙二醛，丙二醛會(huì)與硫代巴比妥酸發(fā)生反應(yīng)形成有色物質(zhì)，測(cè)定TBA值可評(píng)價(jià)貯藏過(guò)程中牦牛肉腸的脂肪氧化程度。牦牛肉腸貯藏期間TBA值的變化見(jiàn)圖2。

圖2 牦牛肉腸貯藏過(guò)程中TBA值的變化

由圖2可知，整個(gè)貯藏期內(nèi)所有組別的TBA均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)(P<0.05),說(shuō)明肉腸在貯藏過(guò)程中發(fā)生了脂肪氧化，且對(duì)照組的增加趨勢(shì)比添加保鮮劑組更顯著(P<0.05)，添加保鮮劑可抑制肉腸中脂肪氧化，高含量LAE組的抑制效果強(qiáng)于低含量LAE組，復(fù)配組的抑制效果強(qiáng)于單一保鮮的抑制效果。LAE+CS組比的抑制脂肪氧化能力稍強(qiáng)于LAE+Nisin組，可能是殼聚糖具有良好的成膜性，能夠選擇性抑制O2滲入，使微環(huán)境中CO2增多，以達(dá)到抗氧化的目的。LAE與Nisin、CS復(fù)配使用時(shí)效果最顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，3種保鮮劑復(fù)配可以協(xié)同降低肉腸中微生物對(duì)脂肪氧化的作用。

2.5 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中持水性的變化

持水性是評(píng)價(jià)肉品品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，對(duì)肉的顏色、嫩度和多汁性都有著直接的影響。肉品的持水性過(guò)低將會(huì)導(dǎo)致肉中營(yíng)養(yǎng)成分，例如游離氨基酸和核苷酸成分流失，降低肉品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[27]。持水性越高說(shuō)明牦牛肉腸中的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，束縛水的能力越強(qiáng)。肉腸在貯藏過(guò)程中部分蛋白質(zhì)會(huì)水解，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞內(nèi)的水分會(huì)向細(xì)胞外逐漸擴(kuò)散，增加汁液流失率，另外，細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶也能加大蛋白的水解程度，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肉腸內(nèi)微生物快速繁殖，加快了細(xì)胞破壞速度與蛋白水解速度，使得牦牛鮮肉腸持水性持續(xù)下降。牦牛鮮肉腸貯藏期間持水性的變化見(jiàn)圖3。

圖3 牦牛鮮肉腸貯藏過(guò)程中持水性的變化

各處理組的持水性在15 d貯藏期內(nèi)呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢(shì)(P<0.05)，其中對(duì)照組的持水性下降最為顯著(P<0.05)，其次是低濃度LAE組與高濃度LAE組，再次為L(zhǎng)AE+Nisin組與LAE+CS組，而LAE+Nisin+CS組在第15天持水性下降最低，說(shuō)明3種保鮮劑復(fù)配能顯著緩減肉腸中水分在外力作用下的流失，結(jié)合殼聚糖對(duì)畜、禽肉制品的持水力以及抗氧化能力對(duì)肉腸品質(zhì)有較好的改善效果，這與王黎明等的研究結(jié)果一致[28]。

3 結(jié)論

LAE具有廣譜抑菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌均有顯著的抑制效果，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌。將LAE單獨(dú)及與天然保鮮劑Nisin和CS復(fù)配用于牦牛鮮肉腸的保鮮，最優(yōu)配方為0.2 g/kg LAE+0.3 g/kg Nisin+5 g/kg CS，在貯藏第15天時(shí)其酸價(jià)、紅度值、亮度值、硫代巴比妥酸分別為0.423 mg/g、10.86 mg/g、39.05 mg/g、0.702 mg/kg，3種保鮮劑復(fù)配能較好地保持牦牛鮮肉腸的貯藏品質(zhì)。通過(guò)將LAE與Nisin、CS復(fù)配可有效抑制貯藏過(guò)程中牦牛鮮肉腸脂肪氧化酸敗，保持較好色澤，延長(zhǎng)保質(zhì)期，為牦牛肉制品保鮮技術(shù)提供了新思路。