響應(yīng)面法優(yōu)化紫甘藍泡菜亞硝酸鹽測定的預(yù)處理條件

陳雪梅，先琳，勾選枝，黎英

(1.龍巖學院 生命科學學院，福建 龍巖 364012；2.閩西特色農(nóng)產(chǎn)品精深加工公共服務(wù)平臺，福建 龍巖 364012)

泡菜是我國傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品的典型代表之一，作為流行較廣的民間食品，其歷史悠久、生產(chǎn)成本低、制作工藝簡單，所得產(chǎn)品脆嫩芳香、口感獨特，深受廣大消費者的喜愛，有著廣闊的市場。但是，泡菜在發(fā)酵期間，乳酸菌之外的一些雜菌(腸桿菌、假單胞菌、黃桿菌屬和葡萄球菌屬)生長繁殖產(chǎn)生的硝酸鹽還原酶會將蔬菜本身含有的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽[1-2]。過量的亞硝酸鹽不僅會使血液中的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，從而導致血液失去運輸氧的能力而引起組織缺氧，而且會與各種胺類反應(yīng)生成亞硝胺，產(chǎn)生極強的致癌作用[3-4]。因此，亞硝酸鹽一直都是泡菜食用安全的重要監(jiān)測項目之一。

目前，測定食品中亞硝酸鹽的依據(jù)是GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》，其中，第二法(即鹽酸萘乙二胺法)是歷年國家標準中都有的方法。該方法的樣品預(yù)處理條件適合肉制品，對于其他樣品僅可作為參考[5]。本法利用亞硝酸鹽在弱酸性條件下與對氨基苯磺酸重氮化后，再與N-1-萘基乙二胺耦合形成紫紅色化合物[6]，使用分光光度計測定吸光度，與標準進行定量比較，且一般的實驗室都具備其測定條件。但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，紫甘藍等具有花青素的泡菜在預(yù)處理過濾后的溶液仍具有一定的顏色，主要原因是乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液脫色能力較差；另外，泡菜在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乳酸等有機酸，有機酸的累積會改變樣液的pH值[7]，這都嚴重影響了比色測定結(jié)果。因此，對于帶有天然色素的泡菜樣品，在測定亞硝酸鹽時有必要對泡菜預(yù)處理條件進行改進或優(yōu)化。

本實驗以紫甘藍泡菜為樣品，研究測定亞硝酸鹽含量時樣品的預(yù)處理方法。采用飽和硼砂溶液進行常溫振蕩提取，再用活性炭和乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液進行脫色澄清，通過單因素實驗和響應(yīng)面實驗研究樣品預(yù)處理時活性炭、硼砂飽和溶液、提取時間和沉淀劑對亞硝酸鹽測定的影響，以加標樣品的回收率為指標，優(yōu)化或改進預(yù)處理條件，以期解決泡菜中天然色素和有機酸對測定的干擾，從而取得更準確的測定結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實驗器材

1.1.1 實驗材料

紫甘藍泡菜：自制，參考文獻[8-9]制作。

1.1.2 實驗設(shè)備

JA202電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；JYL-C19V九陽料理機 九陽股份有限公司；ZWYR-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；PH-3C精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計 廈門柏嘉生物科技有限公司。

1.2 實驗試劑

硼酸鈉、亞硝酸鈉、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、冰醋酸、活性炭粉等：均為AR級。

1.3 實驗方法

1.3.1 亞硝酸鹽標準曲線的繪制

準確移取0.00，0.40，0.80，1.20，1.60，2.00，2.50 mL 5 μg/mL亞硝酸鹽標準使用液(相當于0，2，4，6，8，10，12.5 μg亞硝酸鹽)分別置于25 mL比色管中，于各管中加入4 g/L對氨基苯磺酸溶液2 mL，混勻，靜置3～5 min后，各加入2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液1 mL，加水至刻度，混勻，靜置15 min，用1 cm比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點，于波長538 nm處測吸光度。以吸光度為縱坐標，以標準系列中的亞硝酸鹽質(zhì)量為橫坐標，繪制標準曲線，計算線性方程。

1.3.2 紫甘藍泡菜亞硝酸鹽的測定方法

1.3.2.1 紫甘藍泡菜的預(yù)處理

取紫甘藍泡菜10.0 g→加1倍水勻漿→用100 mL水移至250 mL三角瓶中→加一定量的飽和硼砂溶液和活性炭→常溫振蕩提取一定時間→轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中→加沉淀劑(220 g/L乙酸鋅、106 g/L亞鐵氰化鉀)→定容→靜置30 min→過濾→棄去前30 mL濾液，收集后面的濾液備用。

1.3.2.2 紫甘藍泡菜亞硝酸鹽的測定及計算

取樣品濾液20 mL→顯色→定容至25 mL→于538 nm處測定吸光度→由線性方程計算20 mL樣品濾液中亞硝酸鹽質(zhì)量x→計算樣品中亞硝酸鹽質(zhì)量分數(shù)ω。

式中：ω為樣品中亞硝酸鹽的質(zhì)量分數(shù)，mg/kg；x為20 mL樣品濾液中亞硝酸鹽的質(zhì)量，μg；m為紫甘藍泡菜的質(zhì)量，g；250為樣品處理液總體積，mL；20為比色時取樣品濾液體積，mL。

1.3.3 紫甘藍泡菜預(yù)處理條件的研究

采用單因素實驗，分別研究紫甘藍泡菜樣品預(yù)處理時飽和硼砂用量、活性炭用量、提取時間、沉淀劑用量對亞硝酸鹽測定的影響，以加標樣品回收率為指標，篩選出回收率接近100%的預(yù)處理條件。然后在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面實驗對預(yù)處理條件進一步優(yōu)化。

1.3.4 加標樣品回收率的計算

取兩份重量相同的紫甘藍泡菜，其中一份添加5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液5 mL作為加標樣品。將兩份樣品采用相同的方法進行預(yù)處理并分別測定亞硝酸鹽含量，計算亞硝酸鹽回收率P：

式中：m為紫甘藍泡菜的質(zhì)量，g；ω1為樣品中亞硝酸鹽的質(zhì)量分數(shù)，mg/kg；ω2為加標樣品中亞硝酸鹽的質(zhì)量分數(shù)，mg/kg；m0為加入的亞硝酸鹽標準物質(zhì)的質(zhì)量，μg。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽的標準曲線

以吸光度為縱坐標、亞硝酸鹽質(zhì)量(μg)為橫坐標，繪制的標準曲線見圖1。

圖1 亞硝酸鹽的標準曲線Fig.1 Standard curve of nitrite

由圖1可知，亞硝酸鹽質(zhì)量在0～12.5 μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。回歸方程為y=0.0279x+0.0086，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9971。

2.2 紫甘藍泡菜預(yù)處理的單因素實驗結(jié)果

2.2.1 活性炭用量對亞硝酸鹽測定的影響

取紫甘藍泡菜6份，勻漿，同時準備各加標樣品。在固定飽和硼砂溶液6.5 mL、常溫下200 r/min振蕩提取30 min、沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各5.0 mL的條件下，研究活性炭用量(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g)對亞硝酸鹽回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 活性炭用量對亞硝酸鹽回收率的影響Fig.2 Effect of activated carbon dosage on the nitrite recovery rate

由圖2可知，隨著活性炭用量的增加，回收率先降低再升高，然后再降低?；钚蕴康闹饕饔檬敲摮龢悠分泻械奶烊簧鼗ㄇ嗨?，同時也能澄清濾液。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，當不添加活性炭時，樣品濾液呈微紫紅色，顯色后顏色非常深，吸光度為0.489～0.522，超出測定標準曲線時的吸光度范圍，但回收率僅有58.9%?？梢姡细仕{中天然色素對亞硝酸鹽的比色測定造成很大的干擾。使用活性炭后，樣品濾液變得澄清無色。由于活性炭用量不同，其對紫甘藍色素的脫除率也不同，而紫甘藍色素是由多種花色苷組成的，顏色的變化受pH值的影響較大[10]，所以不同活性炭用量預(yù)處理樣品后測得的亞硝酸鹽回收率不同。當活性炭用量為0.4 g時，亞硝酸鹽回收率最接近100%。

2.2.2 飽和硼砂溶液用量對亞硝酸鹽測定的影響

取紫甘藍泡菜5份，勻漿，在活性炭用量0.4 g、常溫下200 r/min振蕩提取30 min、沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各5.0 mL的條件下，研究飽和硼砂溶液分別為0，3.5，6.5，9.5，12.5 mL時對亞硝酸鹽回收率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著飽和硼砂溶液用量的增加，回收率先升高再降低。飽和硼砂溶液是亞硝酸鹽的提取劑，測定不同飽和硼砂用量下提取液的酸堿性，其pH值分別為4.15，8.79，9.08，9.17，9.22，可見亞硝酸鹽在pH為9.0左右時提取回收率較高。當飽和硼砂用量由6.5 mL增加至12.5 mL時，pH由9.08增加至9.22，增幅緩慢，有類似緩沖溶液的作用。而鹽酸萘乙二胺法的顯色必須在弱酸性條件下，過多的飽和硼砂溶液會影響后續(xù)顯色反應(yīng)的酸堿性，這可能也是硼砂用量多時回收率降低的原因。飽和硼砂用量為6.5 mL時，回收率最接近100%。

圖3 飽和硼砂溶液用量對亞硝酸鹽回收率的影響Fig.3 Effect of saturated borax solution dosage on the nitrite recovery rate

2.2.3 提取時間對亞硝酸鹽測定的影響

將勻漿后的紫甘藍泡菜平均分成5份，在各樣品中加入飽和硼砂溶液6.5 mL、活性炭0.4 g，分別于常溫下200 r/min振蕩提取10，15，20，25，30 min，然后加入乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各5.0 mL，過濾后取樣品濾液顯色測定。樣品提取時間對亞硝酸鹽回收率的影響見圖4。

圖4 提取時間對亞硝酸鹽回收率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the nitrite recovery rate

由圖4可知，隨著提取時間的延長，回收率變化幅度不大，在95%～105%范圍內(nèi)波動，說明提取時間對亞硝酸鹽的影響不大。主要原因是亞硝酸鹽易溶解于水，只要樣品勻漿均勻，就有利于亞硝酸鹽的溶解和提取。出于節(jié)約時間成本的考慮，選擇后續(xù)實驗的提取時間為10 min。

2.2.4 沉淀劑對亞硝酸鹽測定的影響

固定飽和硼砂溶液6.5 mL、活性炭0.4 g、常溫下200 r/min振蕩提取10 min，研究沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液分別為0，1.0，3.0，5.0 mL時對亞硝酸鹽回收率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 沉淀劑用量對亞硝酸鹽回收率的影響Fig.5 Effect of precipitant dosage on the nitrite recovery rate

乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液在使用時等體積混合，通過反應(yīng)會生成氰亞鐵酸鋅沉淀，能吸附樣品中的蛋白質(zhì)、果膠等干擾物質(zhì)，從而使樣液澄清。實驗發(fā)現(xiàn)，不添加沉淀劑的樣品濾液渾濁色暗，從而導致吸光度增大，回收率遠高于100%。而添加沉淀劑的樣品濾液澄清透明，隨著沉淀劑用量的增加，回收率先上升再下降，當沉淀劑用量為3.0 mL時，回收率最接近100%，且沉淀劑由3.0 mL增加至5.0 mL時，回收率略有下降，但變化幅度不大。

2.3 紫甘藍泡菜預(yù)處理條件的優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

單因素實驗結(jié)果表明，紫甘藍泡菜預(yù)處理時活性炭用量、飽和硼砂用量和沉淀劑用量對亞硝酸鹽的測定影響較明顯。為了獲得更好的預(yù)處理條件，選擇活性炭(A)、飽和硼砂溶液(B)、沉淀劑(C)3個因素，以亞硝酸鹽回收率(Y)為響應(yīng)值，采用Design-Expert 7.0軟件提供的Box-Behnken Design設(shè)計17組實驗進行回歸分析，分析各因素及各因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響，并建立數(shù)學模型。實驗的因素水平見表1，實驗結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 The response surface experimental design scheme and results

續(xù) 表

由Design-Expert 7.0軟件分析可得，響應(yīng)值(回收率Y)與各因素之間的回歸方程為：Y=101.02+2.44A-3.30B-1.66C-2.68AB+0.35AC-1.02BC-4.89A2-1.46B2-6.23C2。

由表3可知，該回歸模型的影響顯著(P=0.0011<0.05)，失擬項不顯著(P=0.5894>0.05)，說明該回歸模型與實際情況擬合程度良好，且3個因素對亞硝酸鹽回收率的影響均達顯著水平(P<0.05)，影響大小的順序為B(飽和硼砂溶液)>A(活性炭)>C(沉淀劑)，可見該回歸模型中3個因素對紫甘藍泡菜亞硝酸鹽回收率的影響是可信的，用該方程進行分析和預(yù)測，預(yù)測值和實際測定值之間相關(guān)性較高。

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model of Box-Behnken test design

2.3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

活性炭(A)、飽和硼砂溶液(B)、沉淀劑(C)3個因素交互作用對亞硝酸鹽回收率的影響見圖6。

由圖6可知，AB交互作用的曲面相對陡一些，說明活性炭和飽和硼砂溶液交互作用對回收率的影響更顯著。根據(jù)回歸模型方程預(yù)測回收率為100%的最佳預(yù)處理條件是活性炭0.40 g，飽和硼砂溶液7.85 mL，沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各4.04 mL。在實際操作中將預(yù)處理條件適當調(diào)整：活性炭0.40 g，飽和硼砂溶液7.80 mL，沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各4.00 mL，其他條件為常溫下200 r/min振蕩提取10 min。

2.3.3 最佳預(yù)處理條件的確定

用改進后的最佳預(yù)處理條件和GB 5009.33-2016第二法中的預(yù)處理方法分別對紫甘藍泡菜及加標樣品進行預(yù)處理并測定亞硝酸鹽，做3次平行實驗，所得實驗現(xiàn)象和回收率見表4。

表4 兩種方法的實驗現(xiàn)象及回收率Table 4 Experimental phenomenon and recovery rate of two methods

由表4可知，采用國標方法所得濾液帶有一定顏色，平均回收率為81.3%，3次平行實驗的相對標準偏差RSD=2.42%。采用改進的預(yù)處理方法所得的濾液無色、澄清、透明，平均回收率為98.5%，與國標方法測得的回收率相比，測定結(jié)果的準確性更高；由于消除了樣品天然色素的干擾，3次平行實驗的相對標準偏差也比較小，RSD=0.30%?？梢姡倪M的預(yù)處理方法不僅提高了測定結(jié)果的準確性，而且穩(wěn)定性和重現(xiàn)性也較好。

3 結(jié)論

以紫甘藍泡菜為樣品，采用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽含量，樣品預(yù)處理方法如下：取紫甘藍泡菜10.0 g，加水勻漿，加7.80 mL飽和硼砂溶液和0.40 g活性炭，常溫200 r/min振蕩提取10 min，加入沉淀劑乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液各4.00 mL，定容至250 mL，靜置30 min，過濾，棄去前30 mL濾液，收集后面的濾液備用。

通過對國標預(yù)處理方法適當改進，可得無色澄清樣液，平均加標回收率為98.5%，與國標方法測得的回收率相比，測定結(jié)果不僅準確性更高，而且穩(wěn)定性更好。