劉昱成 韓曉東 雷艷紅 高仙靈 戴 玉 李國(guó)婧 賈永紅**

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物逆境生理與分子生物學(xué)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古赤峰市翁牛特旗農(nóng)牧局，內(nèi)蒙古 赤峰 024500；3.呼和浩特職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051）

植物中存在著多種復(fù)雜的信號(hào)通路，共同調(diào)節(jié)植物的生命活動(dòng)，蛋白質(zhì)的磷酸化/去磷酸化是生物調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程的一種基本機(jī)制[1]，是細(xì)胞信號(hào)通路的重要組成部分[2]。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化分別與蛋白激酶和蛋白磷酸酶有關(guān)，絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族根據(jù)序列的相似性可以分為PPP和PPM 2 個(gè)亞家族，PPP 亞家族包括PP1、PP2A、PP2B 和PP4-7，而PPM 亞家族則是由依賴錳離子和鎂離子的蛋白磷酸酶組成。2C 型蛋白磷酸酶(PP2Cs)屬于PPM 亞家族[3]，是蛋白磷酸酶中最大的一個(gè)亞家族，被認(rèn)為在信號(hào)途徑中作為負(fù)調(diào)控因子起作用，通過(guò)與蛋白激酶相互拮抗進(jìn)而調(diào)控蛋白質(zhì)的磷酸化程度。

PP2Cs 參與多種激素的信號(hào)通路，包括脫落酸（ABA），乙烯等[2,4]，目前研究比較深入的是PP2Cs在ABA 信號(hào)通路中的作用[5,6]。ABA 是植物中抵抗生物脅迫和環(huán)境脅迫的重要激素，可以調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，是一種與滲透脅迫相關(guān)的植物激素[7]。研究發(fā)現(xiàn)，PP2Cs 在ABA 信號(hào)通路中有著重要的作用，如調(diào)控植物抗病[8]、ABA 依賴的植物發(fā)育（包括種子的萌發(fā)、根的伸長(zhǎng)和氣孔的開(kāi)閉等[9-12]）、非生物脅迫（主要為干旱和鹽脅迫[6,13]）和不依賴ABA的抗逆境脅迫[14]等過(guò)程。Xue T 等在擬南芥中鑒定出80 個(gè)PP2Cs 基因，水稻中有78 個(gè)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PP2C 家族是目前發(fā)現(xiàn)的植物中最大的基因家族之一。系統(tǒng)發(fā)育分析將擬南芥和水稻中的PP2Cs 分別劃分為11（包括A-E、F1、F2、G-H家族）和13 個(gè)亞家族（包括A-E、F1、F2、G-L 家族），不同亞家族的植物PP2Cs 參與不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[1]。

中間錦雞兒(Caragana intermedia)屬于豆科錦雞兒屬灌木，生命力頑強(qiáng)，廣泛分布于內(nèi)蒙古干旱以及半干旱地區(qū)[15]，是防治水土流失和土地荒漠化的優(yōu)良造林樹(shù)種之一，對(duì)于保護(hù)環(huán)境及維持生態(tài)平衡有著重要意義[16,17]。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)中間錦雞兒的CiPP2C37-like 蛋白進(jìn)行了表達(dá)，研究了不同因素對(duì)CiPP2C37-like 的酶活性影響。

1 研究材料、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

1.1 研究材料

野生型中間錦雞兒成株葉片采自內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗。

1.2 主要試劑

Imidazole、NaCl（分析純）、Tris-HCl、E·coliDH5α、E·coliBL21、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（Tiangen）、植物總RNA 提取試劑盒（Tiangen）、質(zhì)粒小提試劑盒（上海生工）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金)、EGTA、MgCl2（分析純）、BSA(北京酷來(lái)博科技有限公司)、β-巰基乙醇、Ser/Thr Phosphatase Assay System（普洛麥格）、酵母粉（Thermo）、蛋白胨（Thermo）、IPTG (北京酷來(lái)博科技有限公司)。

1.3 主要儀器

PCR 擴(kuò)增儀（德國(guó)SENSO）、臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Backman Coulter）、滅菌鍋（日本三洋）、凝膠成像儀（德國(guó)SYNGENE）、定量紫外檢測(cè)儀（美國(guó)Quawel）、水平槽電泳儀（中國(guó)六一有限公司）、分析天平（德國(guó)Sartorius）、恒溫培養(yǎng)箱（上海福瑪有限公司）、pH計(jì)（德國(guó)Sartorius）、酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek）、NTA-親和層析柱（上海生物工程有限公司）、超濾管（美國(guó)MiLipore）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 構(gòu)建CiPP2C37-like 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇已知功能的PP2C 基因，利用MEGA 軟件基于1 000 次重復(fù)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

2.2 表達(dá)目的蛋白

2.2.1 RT-PCR 獲得中間錦雞兒cDNA

取一定量的新鮮野生型中間錦雞兒葉片于液氮中保存，將樣品放在研缽中低溫研磨，采用總RNA提取試劑盒（Tiangen）提取中間錦雞兒RNA，提取步驟均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金)對(duì)檸條總RNA 進(jìn)行RTPCR，具體操作均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。得到中間錦雞兒的cDNA 存于-20 ℃冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 構(gòu)建CiPP2C37-like 基因原核表達(dá)載體

根據(jù)cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)得到的CiPP2C37-like 基因序列[16]，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，以檸條cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min；1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。采用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（Tiangen）回收目的基因，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用T4DNA 聚合酶的外切活性產(chǎn)生的粘性末端將目的基因連接到pET-30a 載體上，連接產(chǎn)物42 ℃，熱激45 s 后轉(zhuǎn)入克隆菌株DH5α 中。利用卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆后，挑取單菌落于試管中擴(kuò)增菌體。用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，使用Xho I、Xba I進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證后送華大基因公司測(cè)序。

2.2.3 誘導(dǎo)表達(dá)CiPPC37-like 蛋白

將重組質(zhì)粒42 ℃，熱激45 s 后轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E·coli BL21 中。利用卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆，將篩選出的陽(yáng)性克隆接入終濃度為0.05 mg/mL卡那霉素的100 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)6 h后，將100 mL 菌液接入含有終濃度為0.05 mg/mL 卡那霉素的1L LB 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)震蕩培養(yǎng)2 h，終濃度0.1 mM IPTG、16 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)。

2.2.4 純化CiPPC37-like 蛋白

誘導(dǎo)12 h 后，5 000 r，離心15 min 收集菌體，用30 mL NTA-0（25 mM Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH=8.0）重懸菌體。加入終濃度為1 mM 的DTT，在超聲波信號(hào)發(fā)生器中超聲2 s，間隔4 s，破碎20 min。18 000 r，離心40 min 去除溶液中破碎的菌體。采用Ni-NTA柱純化蛋白上清，分別用25 mL 含有0、10、20、50、100、200、500 mM 咪唑的NTA-0 洗脫目的蛋白，收集含有不同濃度咪唑的NTA-0 洗脫的穿透液，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。采用超濾濃縮去除穿透液中含有的磷離子，得到的粗酶液用于后續(xù)酶活的測(cè)定[18]。

2.3 CiPPC37-like 蛋白酶活的測(cè)定及計(jì)算

CiPP2C37-like 磷酸酶活性的測(cè)定采用絲蘇氨酸磷酸酶測(cè)定系統(tǒng)（普洛麥格），每個(gè)反應(yīng)體系為50 μL，使用NTA-0 調(diào)整蛋白濃度使每個(gè)體系中蛋白含量在5 μg 以下。將10 μL 反應(yīng)緩沖液(50 mM咪唑，pH7.2，5 mM MgCl2，0.2 mM EGTA 和0.1 mg/mL牛血清白蛋白)與5 μL 多肽底物（隨絲蘇氨酸磷酸酶測(cè)定系統(tǒng)試劑盒提供）預(yù)混勻后在對(duì)應(yīng)反應(yīng)溫度下孵育3 min，加入粗酶樣品反應(yīng)15 min。室溫靜置15 min，待顏色穩(wěn)定后測(cè)定600 nm 處的吸光值。

酶活力的定義為：在一定條件下，每分鐘釋放出1 μmoL 的磷酸鹽的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。計(jì)算公式如下：

式中，X 為磷酸酶的酶活力，U/mL；c 為磷酸鹽的濃度，μmol/L；V1為反應(yīng)的總體積，mL；V2為粗酶液的用量，mL；t 為作用時(shí)間，min[19]。

2.3.1 磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用無(wú)磷水（隨絲蘇氨酸磷酸酶測(cè)定系統(tǒng)試劑盒提供）以1∶20 的比例稀釋磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)（隨絲蘇氨酸磷酸酶測(cè)定系統(tǒng)試劑盒提供）。向96 孔板中分別加入0、2、4、10、20 μL和40μL稀釋后的磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液，用1×PP2C 緩沖液將體系補(bǔ)足50 μL。向每個(gè)梯度中加入等體積的鉬酸鹽染料顯色，待顏色穩(wěn)定后測(cè)定600 nm 處的吸光度[20]。

2.3.2 測(cè)定不同溫度、pH 值、金屬離子對(duì)CiPP2C37-like 磷酸酶活性的響應(yīng)

在20～60 ℃的溫度范圍內(nèi)，以5 ℃為間隔設(shè)定溫度梯度，測(cè)定不同溫度下的酶活變化。加入等體積的鉬酸鹽染料顯色，待顏色穩(wěn)定后測(cè)定600 nm處吸光值。分別配置pH 為5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9 的5×PP2C 緩沖液，測(cè)定不同pH 值下的酶促反應(yīng)體系的酶活。金屬離子能夠與酶活性中心結(jié)合，參與電子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，穩(wěn)定酶的構(gòu)象，對(duì)酶活力有著較大的影響。配置終濃度為50 mM 的金屬離子(Cu2＋、Li＋、K＋、Na＋、Ba2＋）5×PP2C 緩沖液，調(diào)節(jié)pH=8.0，以不添加其他金屬離子的PP2C 緩沖液配置酶活體系為對(duì)照，測(cè)定酶活性。

2.3.3 CiPP2C37-like 磷酸酶對(duì)磷酸肽的親和性

將1 mM 的磷酸肽（隨普洛麥格試劑盒提供）按比例分別稀釋至0.25、0.5、1 mM。每50 μL反應(yīng)體系加入5μL底物，底物終濃度分別為0.25、0.1、0.05mM。測(cè)定600 nm 處的吸光值，采用雙倒數(shù)作圖法計(jì)算Km 值。

3 結(jié)果與分析

3.1 原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CiPP2C37-like 蛋白

3.1.1 中間錦雞兒cDNA

為了獲得中間錦雞兒cDNA，以中間錦雞兒葉片為材料，采用總RNA 提取試劑盒（Tiangen）提取中間錦雞兒總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證（圖1），提取的總RNA 略有降解，經(jīng)定量紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，A260/A280=2.153，可用于RT-PCR。

圖1 中間錦雞兒總RNA 瓊脂糖凝膠電泳

3.1.2 CiPP2C37-like 全長(zhǎng)cDNA 的克隆及構(gòu)建pET-30a::CiPP2C37-like 表達(dá)載體

以中間錦雞兒cDNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，獲得CiPP2C37-like 基因，大小為1227 bp。由圖2可見(jiàn)，條帶處于2 000 bp 與1 000 bp 之間，特異性較強(qiáng)，基本符合預(yù)期結(jié)果，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將2.5 μL T4 聚合酶處理的PCR 產(chǎn)物和1 μL同樣經(jīng)T4 聚合酶處理的線性化的pET-30a 載體混合，22 ℃孵育20 min 后加入1 μL 25 mM 的EDTA 終止反應(yīng)，22℃繼續(xù)孵育20 min。熱激轉(zhuǎn)化DH5α，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖3），雙酶切驗(yàn)證成功的質(zhì)粒送華大基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確。

圖3 pET-30a-CiPP2C37-like 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

3.1.3 表達(dá)及純化可溶性CiPP2C37-like 蛋白

為了得到純度較高的CiPP2C37-like 蛋白，對(duì)破碎后的菌體經(jīng)低溫高速離心，取上清進(jìn)行Ni-NTA柱純化。CiPP2C37-like 蛋白大小約為44.88 ku，大部分以包涵體的形式存在于菌體沉淀中，但上清中仍存在部分可溶性蛋白能夠用于酶活性的測(cè)定(圖4)。CiPP2C37-like 蛋白在50 mM 和100 mM 咪唑濃度下被洗脫。將50 mM 和100 mM 咪唑洗脫的穿透液進(jìn)行超濾濃縮，得到粗酶液。

圖4 Ni 柱純化的CiPP2C37-like蛋白SDS-PAGE 電泳

3.2 磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

為獲得用于后續(xù)進(jìn)行酶活力的計(jì)算對(duì)應(yīng)OD值下的磷酸鹽含量，我們繪制了磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制方法均按Ser/Thr Phosphatase Assay System 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。R2=0.997 4＞0.995（圖5），符合標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)，可以用于計(jì)算。

圖5 磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 CiPP2C37-like 磷酸酶活性對(duì)溫度的響應(yīng)

通過(guò)不同溫度對(duì)應(yīng)的吸光度利用磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力用于繪制酶活溫度曲線。在20 ℃到40 ℃之間，隨著溫度的增高，酶活性逐漸增強(qiáng)；40 ℃之后，隨著溫度的升高酶活性逐漸下降（圖6）。表明CiPP2C37-like 反應(yīng)的最適溫度為40 ℃左右。

圖6 溫度對(duì)酶活力的影響

3.4 CiPP2C37-like 磷酸酶為堿性磷酸酶

當(dāng)反應(yīng)體系的pH 值小于7.5 時(shí)，CiPP2C37-like磷酸酶活性較弱，當(dāng)反應(yīng)體系pH 值高于7.5 時(shí)，酶活性緩慢下降（圖7）。綜上，CiPP2C37-like 磷酸酶活性在堿性條件下較強(qiáng)，其最適pH 值為7.5，屬于堿性磷酸酶。

圖7 pH 值對(duì)酶活力的影響

3.5 CiPP2C37-like 磷酸酶活性對(duì)金屬離子的響應(yīng)

以不含金屬離子的酶活反應(yīng)體系為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)Li＋和Ba2＋對(duì)CiPP2C37-like 磷酸酶的活性起到了較為明顯的促進(jìn)作用，K＋和Na＋對(duì)其活性的影響不明顯。當(dāng)反應(yīng)體系中加入Cu2＋時(shí)，酶活性被極大的抑制（圖8），推測(cè)原因可能是Cu2＋與酶的活性中心結(jié)合，改變了酶的構(gòu)象，影響了酶與底物的結(jié)合能力，降低了磷酸鹽的生成速率，導(dǎo)致酶活性降低。

圖8 金屬離子對(duì)酶活的影響

3.6 CiPP2C37-like 蛋白與磷酸肽的親和性

通過(guò)雙倒數(shù)曲線作圖計(jì)算CiPP2C37-like 蛋白與人工合成磷酸肽（隨試劑盒提供）的Km值。根據(jù)擬合趨勢(shì)線y=0.000 4x＋0.0005，算得Km值為0.8（圖9）。

圖9 Km 值的雙倒數(shù)曲線圖

3.7 CiPP2C37-like 與擬南芥中PP2CA 親緣關(guān)系

根據(jù)NCBI 查詢模式植物擬南芥的PP2C 基因，選擇了10 個(gè)已知功能的基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)CiPP2C37-like 基因序列與擬南芥中PP2CA 親緣關(guān)系最近（圖10）。已有研究發(fā)現(xiàn)PP2CA在模式植物擬南芥中負(fù)調(diào)控ABA 信號(hào)通路[21-23]，故預(yù)測(cè)CiPP2C37-like 蛋白可能在中間錦雞兒的ABA 信號(hào)通路中起作用。

圖10 CiPP2C37-like 蛋白與擬南芥中PP2C 的系統(tǒng)進(jìn)化分析

4 結(jié)論

利用原核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)鎳柱純化得到了可溶的、有酶活性的CiPP2C37-like 磷酸酶。確定了CiPP2C37-like 磷酸酶與底物反應(yīng)的最適溫度為40 ℃左右，最適pH 值為7.5。Li＋和Ba2＋能夠明顯增強(qiáng)酶活性，Cu2＋對(duì)酶活性具有抑制作用，其對(duì)絲蘇氨酸磷酸酶測(cè)定系統(tǒng)中的磷酸肽的Km值為0.8。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)CiPP2C37-like 在所有已知功能的PP2C 相關(guān)基因中與PP2CA 的親緣關(guān)系最近，在擬南芥中已揭示部分PP2CA 在ABA信號(hào)途徑中的作用機(jī)理，PP2CA 的缺失導(dǎo)致擬南芥種子萌發(fā)中ABA 高度敏感，抑制ABA 調(diào)控的氣孔閉合[22]，通過(guò)ABA 的受體抑制PP2CA 的蛋白活性和E3 連接酶調(diào)控PP2CA 降解，進(jìn)而調(diào)控ABA 相關(guān)基因表達(dá)[23]，故預(yù)測(cè)CiPP2C37-like 蛋白可能在ABA 信號(hào)通路中起負(fù)調(diào)節(jié)作用，為日后CiPP2C37-like 蛋白質(zhì)在中間錦雞兒中的作用機(jī)理研究提供參考。