馮 磊

（黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081）

黑色素存在于植物、動(dòng)物和微生物中，由于其廣泛來(lái)源及特殊的生物學(xué)意義，黑色素正被廣泛研究。已有研究顯示，黑色素具有降低紫外線輻射傷害、清除體內(nèi)自由基、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等功能[1-3]。本研究利用先前分離的黑木耳黑色素，借助顯微技術(shù)和化學(xué)波譜技術(shù)對(duì)黑木耳黑色素F1的微觀結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)構(gòu)成以及元素組成等結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑木耳黑色素F1為前期實(shí)驗(yàn)分離純化得到。

1.2 黑木耳黑色素F1 的紫外-可見光譜掃描

稱取少量的黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素分別溶于pH 為8 的檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液中，在40 ℃的條件下，在可控溫磁力攪拌器中攪拌溶解1 h，使色素盡可能的溶解，溶液經(jīng)4 000 r/min 離心1 min，取上清液在波長(zhǎng)200～600 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光譜掃描。

1.3 黑木耳黑色素F1 的掃描電子顯微鏡

稱取少量的黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素噴涂Au 后，通過(guò)環(huán)境掃描電子顯微鏡直接成像，觀察黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 黑木耳黑色素F1 的傅里葉紅外變換光譜掃描

采用溴化鉀壓片法，按黑木耳黑色素F1或黑木耳黑色素分別與溴化鉀1∶200 的比例進(jìn)行配比，研成細(xì)粉后進(jìn)行壓片。在500～4000 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定其紅外吸收光譜。

1.5 黑木耳黑色素F1 的核磁共振掃描

將冷凍干燥的黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素分別溶解在DMSO-d6中。1H NMR 的試驗(yàn)條件為：溫度為299.0 K，保留時(shí)間1.000 s，觀測(cè)頻譜寬度8 223.685 Hz，16 個(gè)重復(fù)樣品，觀測(cè)頻率400.10 MHz。13C NMR 的試驗(yàn)條件為：4 mm 的HR MAS 探針，8k Hz 的旋轉(zhuǎn)速率，2 ms 的接觸時(shí)間，5 s 的延遲回收，4 000 的累積。

1.6 黑木耳黑色素F1 的元素組成

黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素的C、H、N、S 百分比含量通過(guò)元素分析儀測(cè)定，條件為氧化管溫度1 150 ℃，還原管溫度850 ℃，試驗(yàn)在高純度氦氣和氧氣的環(huán)境下進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳黑色素F1 的紫外可見光譜特征

將層析分離得到的黑木耳黑色素F1和黑木耳黑色素進(jìn)行紫外可見光譜掃描得到紫外光譜特征圖譜（圖1）?？梢钥闯龊谀径谏氐淖畲笪辗逯翟谧贤獠ㄩL(zhǎng)207 nm 處，黑木耳黑色素F1的最大吸收峰值在紫外波長(zhǎng)212 nm 處，在所設(shè)定的200～600 nm 的紫外可-見光譜掃描范圍內(nèi)在紫外區(qū)具有強(qiáng)吸收，從最大吸收峰值處開始，隨著掃描波長(zhǎng)的逐漸增大，吸光度呈下降的變化趨勢(shì)，具有典型的黑色素紫外吸收?qǐng)D譜特征，這與現(xiàn)有文獻(xiàn)所報(bào)道的不同來(lái)源的黑色素的紫外可見光最大吸收峰值在波長(zhǎng)在210 nm 附近具有較高的一致性。

圖1 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的紫外掃描圖譜

2.2 黑木耳黑色素F1 的微觀形態(tài)

由圖2A 可見，黑木耳黑色素是由表面不規(guī)則的球形單體組成，并且呈層層堆疊結(jié)構(gòu)，通過(guò)軟件測(cè)量黑木耳黑色素單體平均粒徑約為1 μm。大量黑木耳黑色素單體聚合，形成圖2B 所示的較大體積的不規(guī)則塊狀形態(tài)，但是表面的氣孔表示黑木耳黑色素的結(jié)合并不緊密。

黑木耳黑色素F1有更明顯的片層結(jié)構(gòu)，且表面比黑木耳黑色素光滑，單體間結(jié)合的更加緊密（圖2C）。黑色素F1大量聚合后，同樣形成較大體積的不規(guī)則塊狀形態(tài)，但表面比黑色素更光滑致密，說(shuō)明單純黑色素F1比黑色素結(jié)合的更加緊密，單體與單體之間的連接更加堅(jiān)固（圖2D）。

圖2 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的掃描電鏡圖

2.3 黑木耳黑色素F1 的紅外光譜特征

將層析得到的黑木耳黑色素F1經(jīng)溴化鉀壓片，傅里葉紅外光譜掃描得到紅外光譜掃描特征圖譜（圖3）。黑色素F1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與復(fù)雜的生物大分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)十分相似，具有多種官能團(tuán)才得以使其紅外光譜掃描圖中具有多個(gè)寬而強(qiáng)的吸收峰。

圖3 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的傅里葉紅外掃描圖譜

在黑木耳黑色素F1紅外光譜掃描圖譜中，在3 200 cm-1附近出現(xiàn)的寬峰，是由OH 和NH2基團(tuán)伸縮振動(dòng)引起的；在2 950～2 850 cm-1處的吸收峰說(shuō)明有脂肪族C-H 的存在；1 650～1 500 cm-1處的強(qiáng)烈吸收，與芳香族C=C 和COO 的振動(dòng)有關(guān)；1 400～1 200 cm-1位置的吸收峰顯示酚類COH 和吲哚以及NH 的存在；800～600 cm-1范圍的相對(duì)小的吸收峰代表著芳香環(huán)的存在。在黑木耳黑色素的紅外光譜圖譜中，同樣有這些吸收峰。此外，黑木耳黑色素在1 711.98 cm-1處的吸收峰可能是由于-NH 結(jié)構(gòu)及其間的氫鍵的彎曲和振動(dòng)引起的，表明黑色素相比于黑色素F1有更多含量的蛋白質(zhì)結(jié)合在黑色素上。

2.4 黑木耳黑色素F1 的分子結(jié)構(gòu)特征

如圖4 所示，在1H NMR 光譜中，0.8～1.0 ppm 范圍為脂肪族區(qū)，出現(xiàn)的信號(hào)認(rèn)定為烷基片段的CH3基團(tuán)，例如CH2CH3、CH(CH3)2，可能來(lái)自殘留的蛋白質(zhì)；在2.0 ppm 附近的信號(hào)是屬于亞甲基或酯基(-OCOCH3)，表明羧酸結(jié)構(gòu)的存在；在4 ppm 周圍的峰被認(rèn)定為結(jié)合于吲哚或吡咯環(huán)的甲基（NCH3）和結(jié)合到環(huán)上的第一個(gè)位置的-OCH3；6.5和7.3 ppm 的信號(hào)是吲哚或吡咯環(huán)的芳香族氫原子；8.5 ppm 附近的信號(hào)是吲哚或吡咯環(huán)上的羧基質(zhì)子，其中位置在5 ppm 出現(xiàn)的強(qiáng)信號(hào)是溶劑中NaOH 中H 的峰。通過(guò)強(qiáng)酸前后兩次高溫水解，仍然存在一部分的蛋白質(zhì)，這表明黑木耳黑色素密切結(jié)合于蛋白質(zhì)形成一個(gè)非常穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)。

圖4 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的1H NMR 掃描圖譜

在黑木耳黑色素的圖譜中，2.0 ppm 附近的信號(hào)強(qiáng)于黑木耳黑色素F1，說(shuō)明黑木耳黑色素的羧酸結(jié)構(gòu)比例更高；4ppm 周圍的峰面積小于黑木耳黑色素F1，代表吲哚或吡咯環(huán)的比例較小。

由于黑木耳黑色素以及黑色素F1是大分子聚合物，含有的C 原子較多，所以掃描得到的13C NMR圖譜中有多而密的峰。如圖5 所示，光譜可分為三個(gè)區(qū)域：脂肪族區(qū)（10～95 ppm），其主要是指酸水解后仍然結(jié)合于黑木耳黑色素的蛋白質(zhì)、烷基和未環(huán)化的連接到黑色素的L-DOPA。特別是，在35和55 ppm 附近的峰分別是結(jié)合到吲哚或吡咯環(huán)上的甲基（N-CH3），和結(jié)合至環(huán)上的OCH3或未環(huán)化的L-DOPA 上結(jié)合的CH2或CH。芳香族區(qū)（95～145 ppm），這對(duì)應(yīng)于黑色素的吲哚和吡咯基團(tuán)，這些峰主要是構(gòu)成主要骨架的C，不能夠確定的指到黑色素單體單元每一個(gè)C。羰基區(qū)（160～200 ppm），這對(duì)應(yīng)于含有肽鍵與側(cè)鏈羧基和酰胺基團(tuán)的羰基主鏈，通常約在175 ppm。

圖5 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的13C NMR 掃描圖譜

在黑木耳黑色素F1的圖譜中，脂肪族區(qū)（10～95 ppm）的信號(hào)峰略少于黑木耳黑色素，說(shuō)明黑木耳黑色素的羧酸結(jié)構(gòu)比例更高；140 ppm 周圍的芳香族區(qū)（95～145 ppm）的峰面積大于黑木耳黑色素，代表吲哚或吡咯環(huán)的比例較高，更加穩(wěn)固；羰基區(qū)（160～200 ppm）信號(hào)弱與黑木耳黑色素，也證實(shí)了羧基的比例較低。以上結(jié)果與1H NMR 圖譜相互印證，證明黑木耳黑色素含有更多的蛋白質(zhì)，而黑木耳黑色素F1含有更多的用來(lái)構(gòu)成骨架的吲哚或吡咯環(huán)。

根據(jù)1H NMR 圖譜和13C NMR 圖譜并結(jié)合紅外光譜掃描特征圖譜得到基團(tuán)和結(jié)構(gòu)信息，對(duì)黑木耳黑色素的單體化學(xué)式做出預(yù)測(cè)，如圖6 所示，吲哚環(huán)為黑木耳黑色素的主體結(jié)構(gòu)，在環(huán)上結(jié)合著-COOH 和-OR 等基團(tuán)。

圖6 黑木耳黑色素單體化學(xué)式

從表1 可知，黑木耳黑色素的N、C、H、S 元素的含量均高于黑木耳黑色素F1。其中，黑色素的N含量為10.38%高于黑色素F1的N 含量，說(shuō)明黑木耳黑色素可能含有更多的蛋白質(zhì)，這與傅里葉紅外掃描圖的結(jié)果相互印證。

表1 黑木耳黑色素和黑木耳黑色素F1 的元素含量

黑色素按合成途徑分類，可以分為真黑色素，棕黑色素和異黑色素3 種。真黑色素主要是由酪氨酸、多巴、多巴胺、酪胺等氧化聚合而成的；棕黑色素也是由酪氨酸、多巴、多巴胺、酪胺等氧化聚合而成的，其中有半胱氨酸或谷胱甘肽的參與，含有硫和氮原子[5]；異黑色素是在多酚氧化酶存在的情況下通過(guò)多酚的氧化聚合而成的[6,7]。有文獻(xiàn)指出合成的真黑色素中硫元素含量為0.09%，棕黑色素的硫元素含量為9.78%，而異黑色素中不含有硫元素[iv]。黑木耳黑色素F1中硫元素含量為0.698%，數(shù)值介于兩者之間，說(shuō)明同時(shí)含有這兩種黑色素，借助文獻(xiàn)所報(bào)道的數(shù)據(jù)通過(guò)計(jì)算，真黑色素：棕黑色素含量比為13.29∶1。而黑木耳黑色素中硫元素含量為0.943%，與文獻(xiàn)報(bào)道的0.94%有較高的一致性，且真黑色素：棕黑色素為10.36∶1，說(shuō)明黑木耳黑色素含有更多的棕黑色素。

3 結(jié)論

本文確定了黑木耳黑色素改善小鼠缺鐵性貧血的功效組分為黑木耳黑色素F1，并確定了其基本化學(xué)基團(tuán)的骨架結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)試驗(yàn)表明黑木耳黑色素F1的穩(wěn)定性優(yōu)于另外兩種組分，為后續(xù)治療缺鐵性貧血的新型安全的食品藥品開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)。