梁 芳，許申平，張 燕，王默霏，崔 波

蝴蝶蘭基因作為低溫脅迫內(nèi)參基因的研究

梁 芳，許申平，張 燕，王默霏，崔 波*

鄭州師范學(xué)院生物工程研究中心，河南鄭州 450044

實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)因其具有簡單靈敏、準(zhǔn)確高效等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為目的基因表達(dá)水平研究最常用的技術(shù)手段。而結(jié)果的可靠性取決于很多因素，其中使用合適的內(nèi)參基因是qPCR技術(shù)最基本的應(yīng)用前提。許多研究表明沒有一種內(nèi)參基因可以在任何條件下都能穩(wěn)定地表達(dá)。目前尚未見到關(guān)于蝴蝶蘭低溫生長條件下最佳內(nèi)參基因選擇的有關(guān)報(bào)道。蛋白磷酸酶2A（PP2A）是真核生物體內(nèi)一種主要的細(xì)胞內(nèi)源絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。本研究根據(jù)蝴蝶蘭低溫轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果克隆得到1個PP2A的A亞基基因，其cDNA開放閱讀框（ORF）長度為1764 bp，編碼1個含有587個氨基酸的蛋白，將該基因命名為，GenBank登錄號為MW847782。序列分析結(jié)果表明，該基因與其他植物核苷酸序列相似性均在80%以上，氨基酸序列與小蘭嶼蝴蝶蘭PP2A序列相似性為99.66%?；诎被嵝蛄羞M(jìn)化分析結(jié)果表明，蝴蝶蘭PhPP2Aa與小蘭嶼蝴蝶蘭和鐵皮石斛的親緣關(guān)系最近。將蝴蝶蘭與其他7種候選內(nèi)參基因（、、、、、及）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，用3種常用內(nèi)參基因分析軟件對各個基因值進(jìn)行穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明蝴蝶蘭8個候選內(nèi)參基因在低溫脅迫條件下表達(dá)水平最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)?，其次為；最不穩(wěn)定的基因?yàn)?，其次為。以蝴蝶蘭作為內(nèi)參基因探討低溫脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示蝴蝶蘭的表達(dá)模式符合低溫脅迫條件下的表達(dá)特性。該結(jié)果表明蝴蝶蘭基因可作為低溫脅迫條件下目的基因轉(zhuǎn)錄水平研究的內(nèi)參基因。

蝴蝶蘭；蛋白磷酸酶2A；內(nèi)參基因；低溫脅迫；序列分析

蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是真核生物體內(nèi)一種主要的細(xì)胞內(nèi)源絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。PP2A在植物體內(nèi)參與多種激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，由PP2A介導(dǎo)的蛋白去磷酸化在植物生物、非生物脅迫調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1-4]。此外，PP2A還參與植物細(xì)胞的油脂代謝[5]和氮代謝[6]、光信號途徑[7]及開花時間調(diào)控過程[8]等。PP2A由65kDa結(jié)構(gòu)亞基A、36kDa催化亞基C和多種功能特異的調(diào)節(jié)亞基B組成，保守的A亞基和C亞基形成二聚體核心酶，再與高度變異的B亞基構(gòu)成具有生物活性的全酶[9]。每個亞基都有多個基因編碼，在擬南芥中，有3種A亞基、17種B亞基和5種C亞基[10]。A亞基由一系列保守的α螺旋重復(fù)序列組成，而且提供與B亞基和C亞基的結(jié)合位點(diǎn)[11]。在植物中A亞基（PP2Aa）由一到數(shù)個基因編碼，在擬南芥中編碼A亞基的基因有3個，分別為、和，其中在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期起正調(diào)控作用，并影響生長素的轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。有研究表明參與植物脅迫響應(yīng)[13]，當(dāng)功能缺失時，和才發(fā)揮生物學(xué)作用[14]。

蝴蝶蘭（spp.）原產(chǎn)于熱帶亞熱帶地區(qū)，性喜暖畏寒，在我國北方地區(qū)種植時，低溫成為影響其正常生長的重要環(huán)境因子。因此，耐冷性資源和基因挖掘是蝴蝶蘭育種工作的重要目標(biāo)之一。在蝴蝶蘭耐冷性基因篩選過程中，實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）是較為常用的技術(shù)手段，而qPCR技術(shù)的應(yīng)用前提之一是合適內(nèi)參基因的選擇。目前在蝴蝶蘭內(nèi)參基因篩選及低溫條件下目的基因表達(dá)水平研究中，尚未見到關(guān)于低溫生長條件下最佳內(nèi)參基因選擇的有關(guān)報(bào)道。傳統(tǒng)的內(nèi)參基因很多，本研究從低溫轉(zhuǎn)錄組文庫中，篩選表達(dá)相對穩(wěn)定的3個常用內(nèi)參基因、、及5個新型內(nèi)參基因、、、和作為候選內(nèi)參基因，采用3個常用內(nèi)參基因分析軟件geNorm[15]、NormFinder[16]和BestKeeper[17]對這8個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，并用蝴蝶蘭低溫脅迫響應(yīng)基因作為驗(yàn)證[18]。該結(jié)果為蝴蝶蘭低溫脅迫條件下基因表達(dá)分析及功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以正常生長溫度的葉片為對照1（CK1）取樣，16℃/11℃處理3 d后為對照2（CK2）取樣，于11℃/6℃處理后1 d（T1）、2 d（T2）、3 d（T3）、5 d（T5）和7 d（T7）取樣。

1.2 方法

1.2.1 蝴蝶蘭基因序列分析 根據(jù)蝴蝶蘭低溫脅迫條件下葉片轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，獲得一條蝴蝶蘭基因，在其ORF區(qū)兩端設(shè)計(jì)引物并克隆全長序列，利用DNAMAN軟件比對其推導(dǎo)的氨基端序列的同源性，用Clustal X和MEGA構(gòu)建該基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析進(jìn)化關(guān)系。

1.2.2 候選內(nèi)參基因的實(shí)時熒光定量分析 根據(jù)低溫轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，挑選8個候選內(nèi)參基因，其readcount值在不同處理時間中相對穩(wěn)定。分別設(shè)計(jì)qPCR引物，如表1所示。利用SYBR?Premix Ex TaqTMII對不同高溫脅迫處理時間后各基因表達(dá)情況進(jìn)行qPCR反應(yīng)檢測，反應(yīng)總體系為20.0 μL，其中2×SYBR Premix ExII 10.0 μL，引物F和R各0.8 μL，cDNA 模板2.0 μL；ddH2O 6.4 μL；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸15 s，共40個循環(huán)。qPCR反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler ep realplex2熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每個樣品3次重復(fù)，并做陰性對照。PCR反應(yīng)完成后，經(jīng)儀器自動分析，查看每個基因的擴(kuò)增情況，并導(dǎo)出相應(yīng)的值。

表1 引物序列及用途

1.2.3 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析 根據(jù)得到的各個候選內(nèi)參基因的值，利用分析軟件GeNorm、Bestkeeper和NormFinder對8個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，篩選蝴蝶蘭低溫生長條件下的最適內(nèi)參基因。

1.2.4 內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取等量不同低溫處理時間葉片的7個cDNA樣品，混合均勻作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別稀釋10倍、100倍、1000倍和10 000倍及未稀釋樣品作為5個梯度，分別以5個梯度的cDNA為模板，以表1中設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行qPCR反應(yīng)，20.0 μL反應(yīng)體系配置及反應(yīng)條件同1.2.2。

1.2.5 蝴蝶蘭基因在低溫條件下的表達(dá) 以蝴蝶蘭基因作為內(nèi)參基因，以為對照，檢測NAC域蛋白基因在蝴蝶蘭低溫脅迫條件下不同處理時間葉片中的表達(dá)特性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶蘭PhPP2Aa基因的克隆與序列分析

以蝴蝶蘭葉片提取的cDNA第一鏈為模板，克隆得到基因目的片段1859 bp，ORF區(qū)全長為1764 bp，編碼587個氨基酸。將蝴蝶蘭基因序列進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭與小蘭嶼蝴蝶蘭（，XM_ 020743358.1）核苷酸序列有31個不同堿基，序列相似性為99.15%；與鐵皮石斛（，XM_020819773.1）序列相似性為93.82%；與油棕（，XM_ 010943973.2）、鳳梨（，XM_0202 44641.1）、海棗（，XM_0087 84816.3）等植物序列相似性均在80%以上。表明該基因?yàn)榫幋aPP2A的A亞基的β基因，因此命名為，GenBank登錄號為MW847782。

將該基因推導(dǎo)的氨基酸序列與NCBI中其他9種相似度較高的植物PP2A蛋白進(jìn)行多序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PhPP2Aa與小蘭嶼蝴蝶蘭PP2A氨基酸序列有1個不同，序列相似性為99.66%，在第353位的氨基酸由D（天冬氨酸）變?yōu)镋（谷氨酸）。與其他8種植物的氨基酸序列有多個位點(diǎn)不同，其中在第55位氨基酸由E變?yōu)镈，第314位氨基酸由Q（谷氨酰胺）變?yōu)镋，第322位氨基酸由P（脯氨酸）變?yōu)門（蘇氨酸）（圖1）。

在NCBI上下載了其他19種植物基因的氨基酸序列與蝴蝶蘭的序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，這些植物的PP2A氨基酸序列明顯分為2個大分支，蝴蝶蘭PhPP2Aa（hydrid，MW847782）與小蘭嶼蝴蝶蘭（，XM_020743358.1）的PP2A進(jìn)化關(guān)系最近，其次是蘭科植物的鐵皮石斛（，XM_020819771.2），三者處于同一個進(jìn)化分支；與玉米（，XM_008650108.2）、水稻（，AJ243828.1）、油棕（，XM_010930760.2）等單子葉植物均處于一個大分支；而另一個大分支為罌粟（，XM_026547132.1）、蓮（，XM_010266882.2）、葡萄（，XM_002276144.4）、陸地棉（，XM_016854089.1）等雙子葉植物。表明基因的進(jìn)化在單雙子葉植物中具有高度的保守性。

以藥物不良反應(yīng)這一節(jié)為例，該章節(jié)的重點(diǎn)在于掌握藥物不良反應(yīng)分類及發(fā)生機(jī)制，難點(diǎn)在于診斷藥物不良反應(yīng)的主要依據(jù)，在教學(xué)中教師需重點(diǎn)突出本章與醫(yī)院臨床藥學(xué)實(shí)踐緊密相結(jié)合的特點(diǎn)，爭取將學(xué)生的思維引導(dǎo)到如何在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)、判斷ADR。筆者在該部分內(nèi)容的教學(xué)設(shè)計(jì)中引入BOPPPS模式，具體設(shè)計(jì)見表1、表2。

圖1 蝴蝶蘭PhPP2Aa基因編碼的氨基酸序列與其他植物PP2A的多序列比對

圖2 蝴蝶蘭PhPP2Aa與其他PP2A蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 蝴蝶蘭候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

由圖3可知，蝴蝶蘭的8個候選內(nèi)參基因PCR結(jié)果條帶單一，擴(kuò)增產(chǎn)物大小位置與預(yù)期結(jié)果一致，且擴(kuò)增曲線顯示均為單峰，表明所設(shè)計(jì)的引物可用于目的基因的qPCR分析。

圖3 蝴蝶蘭候選內(nèi)參基因的qPCR擴(kuò)增結(jié)果

8個候選內(nèi)參基因在蝴蝶蘭低溫處理不同時間下的表達(dá)值在19.11～27.55之間（圖4A），其中以的值最小，表達(dá)豐度最高；的值最大，表達(dá)豐度最低（圖4B）。

采用3個常用軟件geNorm、NormFinder和BestKeeper對8個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。geNorm和NormFinder是根據(jù)值判斷，值越小，表明基因穩(wěn)定性越高；值越大，穩(wěn)定性越低。BestKeeper是根據(jù)±值來判斷，值越小，表明該基因穩(wěn)定性越高。如表2所示，geNorm和NormFinder分析結(jié)果均表明，和的值最小，穩(wěn)定性最高，其次為。BestKeeper分析結(jié)果表明，的值最小，穩(wěn)定性最高，其次為。3個軟件的分析結(jié)果均表明最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是，其次是。綜合分析表明，蝴蝶蘭8個候選內(nèi)參基因在低溫脅迫條件下表達(dá)水平最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是，其次是。

A：Ct平均值分布圖；B：Ct平均值箱式圖。

periods of cold treatment

表2 蝴蝶蘭候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3 蝴蝶蘭PP2A基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

由實(shí)時熒光定量PCR儀自動生成熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，基因的qPCR熔解曲線均為單峰，表明所設(shè)計(jì)的引物具有特異性，產(chǎn)物單一；基因的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線為= –3.299+20.17，擴(kuò)增效率為101%，相關(guān)系數(shù)為0.999。

2.4 蝴蝶蘭PP2A基因作為內(nèi)參基因檢測低溫下PhNAC1表達(dá)量

以蝴蝶蘭為內(nèi)參基因，檢測基因在低溫處理不同時期葉片中的表達(dá)情況，以常用的基因?yàn)閷φ?。結(jié)果表明，蝴蝶蘭在11℃/6℃低溫處理?xiàng)l件下，基因相對表達(dá)量在CK2（低溫馴化階段后）中明顯上升；當(dāng)逐步降溫過程結(jié)束進(jìn)行11℃/6℃處理1 d后（T1），表達(dá)量開始下降，之后又逐漸升高，第5天時（T5）達(dá)到最高?；蛟?個蝴蝶蘭品種中不同低溫處理時間下的相對表達(dá)水平，與以為內(nèi)參基因時基因表達(dá)量變化總體趨勢基本一致（圖5）。表明以為內(nèi)參基因進(jìn)行相關(guān)基因分析結(jié)果是可靠的。

圖5 蝴蝶蘭PhNAC1基因在低溫脅迫條件下的表達(dá)特性

3 討論

由于qPCR具有簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于目的基因轉(zhuǎn)錄水平研究[19]。應(yīng)用過程中為了保證結(jié)果的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性，有很多需要遵循的原則，其中最基本的先決條件就是使用可靠的內(nèi)參基因[20]。理想的內(nèi)參基因要求能不受RNA量及各種實(shí)驗(yàn)條件和環(huán)境的影響，但是大量研究表明即使是被廣泛運(yùn)用的內(nèi)參基因，其表達(dá)水平也會隨著物種、組織及處理的不同而不同，沒有一種內(nèi)參基因被證明可在任何條件下均表達(dá)穩(wěn)定[21]。因此，在進(jìn)行目的基因表達(dá)水平研究時，首先篩選在特定條件下合適的內(nèi)參基因是一項(xiàng)重要的任務(wù)。雖然蝴蝶蘭的內(nèi)參基因研究已有報(bào)道[22]，但只研究了蝴蝶蘭在正常溫度下營養(yǎng)生長及生殖生長過程中目的基因研究的最適內(nèi)參基因，尚未見到溫度脅迫下內(nèi)參基因研究的相關(guān)報(bào)道。

較早使用的內(nèi)參基因主要是看家基因，如、、等，近年來又有很多新的內(nèi)參基因的相關(guān)研究，如、、等。有報(bào)道表明在甘草及海州常山干旱條件下[23-24]、板藍(lán)根ABA處理?xiàng)l件下[25]及冬油菜冷脅迫條件下的表達(dá)均最為穩(wěn)定[26]。和在香蕉溫度脅迫時表達(dá)最穩(wěn)定[27]；在早熟禾低溫脅迫下的根中表達(dá)最穩(wěn)定[28]。在甘薯、黃梁木及海州常山鹽脅迫條件下的研究表明的表達(dá)最穩(wěn)定[24, 29-30]，并指出和雖然被廣泛使用，但在甘薯不同品種中的研究表明其表達(dá)并不是最穩(wěn)定的[20]。大豆在鎘脅迫條件下，、及的表達(dá)最穩(wěn)定，表達(dá)最不穩(wěn)定[31]；在山胡椒中的研究表明，和在不同組織及果實(shí)發(fā)育期表達(dá)最穩(wěn)定[32]。作為內(nèi)參基因的應(yīng)用已有許多報(bào)道，如作為油菜成熟胚中目的基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因[33]、橄欖的中果皮[34]、鷹嘴豆不同組織中[35]、生菜生長發(fā)育過程中[36]、鼠尾草的生殖階段[37]、狗尾草[38]、白楊的不定根再生階段[39]。由此可見，不同物種、不同條件或組織，最佳內(nèi)參基因是不同的。因此，本研究從8個候選內(nèi)參基因中，利用常用的3種內(nèi)參基因分析軟件，篩選出基因作為研究蝴蝶蘭在低溫條件下目的基因表達(dá)功能研究的內(nèi)參基因，其次為基因。也有相關(guān)報(bào)道作為低溫脅迫條件下的最佳內(nèi)參基因，如對葡莖剪股穎在冷脅迫條件下內(nèi)參基因表達(dá)情況的研究表明，最佳內(nèi)參基因?yàn)楹偷穆?lián)合使用[40]。

本研究獲得了蝴蝶蘭基因的全長序列，經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)與其他植物核苷酸序列相似性在80%以上。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，蝴蝶蘭與小蘭嶼蝴蝶蘭的基因氨基酸序列完全相同，與蘭科植物鐵皮石斛的親緣關(guān)系最近，三者處于同一進(jìn)化分支。以往的研究表明，蝴蝶蘭基因在低溫脅迫條件下表達(dá)量會逐漸升高，本研究用基因驗(yàn)證作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，同時以常用內(nèi)參基因?yàn)閷φ眨Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，以和為內(nèi)參基因時，基因在蝴蝶蘭不同低溫處理時間下的相對表達(dá)水平變化總體趨勢基本一致，表明以為內(nèi)參基因進(jìn)行相關(guān)基因分析結(jié)果是可靠的。綜上所述，通過對蝴蝶蘭基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析及驗(yàn)證，表明該基因在蝴蝶蘭正常生長溫度及低溫脅迫條件下，不同時間的葉片中均能穩(wěn)定表達(dá)，說明基因可作為蝴蝶蘭低溫脅迫條件下的內(nèi)參基因使用，為研究蝴蝶蘭低溫脅迫條件下相關(guān)基因的表達(dá)特性分析、耐冷性資源及基因挖掘奠定基礎(chǔ)。

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as Reference Gene inunder Low-temperature Stress

LIANG Fang, XU Shenping, ZHANG Yan, WANG Mofei, CUI Bo*

Bioengineering Research Center, Zhengzhou Normal University, Zhengzhou, Henan 450044, China

Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) analysis, with the benefits of simplicity, high sensitivity, accuracy and high-throughput characteristics, has been used in many fields to quantify the transcript levels of target genes. There are many rules that must be followed to ensure the reproducible and accurate expression profiles of target genes using qPCR. Among them, the use of a reliable internal control known as a reference gene for data normalization is the elementary prerequisite for valid results and proper analysis. Numerous studies have suggested that no single reference gene is always expressed stably under any condition. There are no reports on the selection of optimal reference genes forunder low temperature conditions. Protein phosphatase 2A (PP2A) is a major intracellular serine / threonine protein phosphatase in eukaryotes.A subunit gene of PP2A was cloned by the results of the transcriptome sequencing ofhybrid under cold stress, which was namedand the GenBank accession number was MW847782. The coding region (ORF) ofwas 1764 bp, encoding 587 amino acids. Homologous alignment showed that it shared over 80% nucleotide sequence similarity within other plants, and that it shared 99.66% amino acid sequence similarity with. The phylogenetic tree analysis based on the amino acid suggested that the relationship of PP2A betweenhybrid,andwas close, which belonged to the same branch. Three conventional software (geNorm, NormFinder, BestKeeper) were used to analyze the expression stability of 8 candidate reference genes (,,,,,,and) from. The results showed that the most stable reference gene was, followed by. And, the most unstable was, followed by. Usingof() as the reference gene to explore transcriptional profile of the target gene, the results demonstrated that the expression pattern ofwas consistent with its characterize under cold stress. Therefore,can be used as the internal reference gene for the analysis of target gene inunder low-temperature stress.

; protein phosphatase 2A; internal reference gene; low-temperature stress; sequence analysis

Q785；Q786

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.07.004

2022-02-10；

2022-03-19

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（No. 212102110116，No. 222102110470）；河南省高校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（No. 22A210025）。

梁 芳（1982—），女，博士，講師，研究方向：花卉分子育種。*通信作者（Corresponding author）：崔 波（CUI Bo），E-mail：cuibo@zznu.edu.cn。