羅思曼，胡博洋，胡國帥，趙麗君，柳慶月，楊江科

（武漢輕工大學 生命科學與技術學院，湖北武漢 430023）

隨著全球化和工業(yè)化的進一步發(fā)展，人們對能源的需求日益增加。有限的化石能源儲量越來越難以滿足日益增長的能源需求，而且傳統(tǒng)的化石能源在使用后會帶來嚴重的環(huán)境污染問題。為解決能源危機，各國都在積極尋找可再生的替代能源。生物柴油就是以動植物油脂、食用廢油等為原料制備而成的可再生的清潔能源物質(zhì)。與傳統(tǒng)的化石能源相比，生物柴油具有原料可再生、生物降解、對環(huán)境友好等諸多優(yōu)點[1-2]。我國自21世紀初大力發(fā)展生物柴油以來，已經(jīng)形成了約200萬t/a的產(chǎn)能規(guī)模，生產(chǎn)技術達到世界先進水平，是主要的生物柴油出口國[3]。

我國是食用油脂消費大國，年均油脂消耗量居世界首位，且每年都會產(chǎn)生大量的食用廢油。食用廢油成分復雜，除含有大量的烴類及其衍生物外，還含有重金屬、過量的飽合脂肪酸和有毒致癌物等，因此一旦食用廢油流向餐桌，將會給廣大消費者的健康帶來極大的危害。但食用廢油也是優(yōu)質(zhì)的能源，以食用廢油為原料，將其轉(zhuǎn)化為清潔能源特別是生物柴油不僅可以減少柴油燃燒帶來的污染，實現(xiàn)健康、環(huán)保的生活模式，而且還能因地制宜地解決廢油所帶來的危害[4]。

目前，應用最為廣泛的生物柴油制備方法包括化學法和生物合成法（脂肪酶催化法）。與化學方法相比，脂肪酶替代化學催化劑，具有無污染、低能耗、轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點，是一種綠色催化劑[5-6]。在脂肪酶催化法中，酶的活性、穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)化條件等對實驗轉(zhuǎn)化效率的影響較大[7]，特別是直接以液體脂肪酶為催化劑，需要酶具有產(chǎn)量高、抗逆性強、穩(wěn)定的特點。米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzaelipase，ROL）在催化轉(zhuǎn)化上有一定的優(yōu)勢，但要實現(xiàn)工業(yè)化應用不僅需要脂肪酶的高效表達，還需要脂肪酶對催化反應環(huán)境具有良好的耐受性[8]。

本研究將利用基因工程手段對ROL進行改造，并在畢赤酵母X-33中高效表達，高效地將廢棄油脂轉(zhuǎn)化為生物柴油，充分發(fā)揮ROL的優(yōu)勢，改善工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

載體pPICZα-A、大腸桿菌感受態(tài)DH5α、畢赤酵母X-33，均由本實驗室保藏；ROL基因，GenBank登錄號AF229435；蛋白胨和酵母提取物，英國OXOID公司；DNA膠回收盒、質(zhì)粒抽提試劑盒（離心柱型），美國0mega公司；DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BglⅡ、Protein Marker、博來霉素（Zeocin）及PCR相關試劑，美國Invitrogen公司。

5427 R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；PRO-96型PCR儀，德國Biometra公司；DYCP-31CN瓊脂糖水平電泳儀、DYCZ-24DN雙垂直蛋白電泳儀，北京六一生物科技有限公司；YJ-1340型潔凈工作臺，蘇州市蘇信凈化設備廠；GeneGenius自動凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene公司；7890A氣相色譜儀，美國Agilent公司；FM 100制冰機，北京長流科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ROL的分子改造

在ROL原始氨基酸序列上（GenBank登錄號：1LGY），通過理性設計改變其中2個位點的氨基酸。將61位上的絲氨酸突變成蘇氨酸（S61T），將150位點上的谷氨酸胺突變?yōu)榱涟彼幔℅150L）。采用Aliview軟件比較設計前后氨基酸序列的不同，并用作圖軟件Pymol將突變位點改變前后的狀態(tài)表示出來。

1.2.2 ROL基因的構建與表達

將改造前后的脂肪酶基因序列克隆到pPICZα-A中，構建重組質(zhì)粒pPICZα-A -proROL。并用BamHⅠ和BglⅡ兩個酶將重組質(zhì)粒進行雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳顯示目的基因片段大小，驗證是否成功構建重組質(zhì)粒pPICZα-A-mROL。

將重組質(zhì)粒pPICZα-A-proROL通過BamHⅠ內(nèi)切酶單酶切線性化后，電轉(zhuǎn)（1 200 mV，56 ms）入畢赤酵母X-33中，放入28 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h后涂布于Zeocin抗性YPD平板上，獲得含pro-ROL基因的畢赤酵母重組菌株[9]。含改造后的m-ROL基因的畢赤酵母重組菌株的構建方法同pro-ROL。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵與誘導表達

挑選原始脂肪酶基因和優(yōu)化后的重組菌株接種于含Zeocin（70 μL /100 mL）抗性的4 mL YPD培養(yǎng)基中，在28 ℃搖床中培養(yǎng)16 h后，取3 mL到25 mL的BMGY培養(yǎng)基中，從放入28 ℃，180 r/min的搖床開始計算，每1 d加入500 μL 2%的甲醇進行誘導表達，3 d后停止發(fā)酵。取離心后的發(fā)酵液上清液20 μL，并加入蛋白loading buffer，混合均勻后在100 ℃水浴鍋中煮5 min后，進行15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。實驗重復6次，觀察結果重現(xiàn)性。

1.2.4 酶學性質(zhì)測定

在一定條件下，脂肪酶可以水解油脂類，生成脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯等物質(zhì)，可以通過氫氧化鈉標椎溶液來滴定生成的脂肪酸，以此來測定生成的脂肪酸的量。基于該反應原理，本文選取堿式滴定法來測定酶活。

取橄欖油乳化液4 mL，pH值7.0的Tris-HCl緩沖液5 mL放入100 mL錐形瓶，先將混合液置于40 ℃水浴鍋中預熱2 min，再加入離心后的發(fā)酵液上清液1 mL，反應過程中通過搖晃錐形瓶來增加溶液之間的接觸，以此來提高反應速率。反應10 min后，加入15 mL 95%的酒精終止反應，空白對照組加入終止液后再加入酶液。加入60 μL的酚酞后，用0.4%的氫氧化鈉溶液進行滴定，滴至溶液偏紅且紅色不褪色，停止滴定并記錄消耗的氫氧化鈉的體積，空白組同樣進行滴定。酶活計算公式：

式中：酶活為在40 ℃，pH=7.5的條件下，脂肪酶水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1 μmoL脂肪酸的酶量；V2為實驗組消耗氫氧化鈉的體積，mL；V1為空白組消耗氫氧化鈉的體積，mL；M為氫氧化鈉的濃度，mol/L；N為稀釋倍數(shù)；t為反應時間，min。

在不改變酶學體系的條件下，改變反應溫度（從20 ℃到70 ℃），以此來測定溫度對ROL酶活的影響；反應溫度40 ℃不變的條件下，改變緩沖液pH值（從5到10），以此來測定pH對ROL酶活的影響。

1.2.5 生物柴油制備

酶促轉(zhuǎn)脂化制備生物柴油，在50 mL具塞錐形瓶中，加入適量的廢棄油脂和叔丁醇、甲醇的混合物，放于搖床中，加熱至35 ℃后，加入12%的脂肪酶開始反應，每隔2 h取出反應液，用于甲酯含量分析。將所取的100 μL反應液離心分層，取上層液樣5 μL，用295 μL正己烷溶解，加入300 μL內(nèi)標物（十七碳酸甲酯正己烷溶液），混勻，取1 μL樣品進樣。

生物柴油是脂肪酸甲酯的混合產(chǎn)物，包括硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯等，所以為了確定生物柴油當中各成分的含量以及生物柴油的轉(zhuǎn)換率，采用氣相檢測器進行物質(zhì)分離以及定量測定。

1.3 氣相檢測儀器的參數(shù)

氣相色譜柱：安捷倫7890A，毛細管柱；載氣：氮氣；檢測器：FID；進樣方式：分流；升溫程序：初始柱溫：200 ℃，10 min后維持每3 min上升2 ℃；進樣口溫度240 ℃；檢測器溫度：300 ℃。

2 結果與分析

2.1 ROL的分子設計

由圖1A ROL的空間結構知，本研究主要對ROL第61位上的絲氨酸和第150位點上的谷氨酸進行了突變。由圖1B（1）和圖1B（2）知，當?shù)?1位上的絲氨酸（Ser）突變成蘇氨酸（Thr）后，絲氨酸與63位上的蘇氨酸之間的氫鍵斷裂，與蘇氨酸間重新形成更短的氫鍵。氫鍵在維持蛋白質(zhì)空間結構中起著重要的作用，鍵長變短，鍵能減小，脂肪酶ROL的空間結構更穩(wěn)定。由圖1B（3）和圖1B（4）知，將150位點上的谷氨酸（Glu）突變?yōu)榱涟彼幔↙eu），空間距離變大，作為蛋白質(zhì)折疊驅(qū)動力的疏水作用增強，也增加了其空間結構的穩(wěn)定性[10]。

圖1 ROL蛋白質(zhì)展示圖及兩個突變位點

2.2 ROL重組表達載體的構建

脂肪酶重組表達載體的構建如圖2所示。圖2A為原始脂肪酶pro-ROL和改造后脂肪酶m-ROL片段大??；圖2B為用BamHⅠ和BglⅡ2個限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒和空載體進行雙酶切，以及用BamHⅠ對重組質(zhì)粒進行單酶切，與目的片段大小進行對比，結果顯示兩者大小相同。結果表明，本研究成功地獲得了重組質(zhì)粒pPICZα-A–proROL和pPICZα-A-mROL。

圖2 米根霉脂肪酶重組載體的構建

2.3 脂肪酶重組子在搖瓶條件下的蛋白表達量及酶活分析

在搖瓶條件下進行pro-ROL和m-ROL重組子的發(fā)酵工藝研究，結果如圖3所示。對發(fā)酵完成后的上清液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，顯示優(yōu)化后的ROL表達量明顯優(yōu)于原始脂肪酶，優(yōu)化前的脂肪酶含量為0.18 mg/mL，優(yōu)化后的含量為0.59 mg/mL。當培養(yǎng)時間為72 h時，優(yōu)化前的酶活含量約280 U，優(yōu)化后的酶活平均為1 430 U/mL，比優(yōu)化前酶活大幅度提高5.1倍，遠高于現(xiàn)有研究結果[11]。

圖3 pro-ROL和m-ROL表達產(chǎn)物的分析

2.4 ROL優(yōu)化前后酶學性質(zhì)分析

2.4.1 最適反應溫度測定

將酶液樣品在20 ℃到70 ℃溫度下，按前述體系以及實驗操作測定酶活，以溫度為橫坐標，以相對酶活（以40 ℃下m-ROL的酶活基準）為縱坐標，作曲線圖，見圖4A。結果發(fā)現(xiàn)，米根霉脂肪酶的最適溫度在40 ℃，酶活隨著溫度的升高先增加再減小，當溫度達到40 ℃時，ROL酶活達到最高。

圖4 溫度和pH對酶活的影響

2.4.2 最適pH測定

將酶液樣品置于pH=4～10的不同緩沖液中，按上述體系以及實驗操作測定酶活，以pH為橫坐標，以相對酶活（以pH=8時m-ROL的酶活為基準）為縱坐標，坐曲線圖。由圖4B知，在最適溫度40 ℃下，ROL的最適pH在8.0。本實驗中測得的最適溫度與pH與已有研究結果一致[11]。

2.5 ROL生物柴油轉(zhuǎn)化效率數(shù)據(jù)分析

國內(nèi)外現(xiàn)有許多研究也是用叔丁醇作為有機溶劑介質(zhì)進行實驗反應，這是由于叔丁醇本身是相對親水的，而且甲醇和反應產(chǎn)物也可以溶解在其中，使得反應體系是均相的[12]。

本研究考察了反應體系中脂肪酶的添加量對轉(zhuǎn)化效率的影響。由圖5A知，當脂肪酶的添加量為反應體系的10%時生物柴油脂肪酸甲酯的產(chǎn)率最高。當酶量進一步升高時，生物柴油的產(chǎn)率反而降低。在最適酶量的情況下，本研究在甲醇和廢棄油脂的摩爾比例達到4∶1，叔丁醇占油脂相對質(zhì)量分數(shù)80%的時候，比較分析了原始脂肪酶與優(yōu)化后脂肪酶的轉(zhuǎn)酯效率。當反應時間在18 h時，m-ROL的脂肪酸甲酯的產(chǎn)率可以達到80.4%,而pro-ROL脂肪酸甲酯的產(chǎn)率僅為45.3%（見圖5B）。

圖5 生物柴油脂肪酸甲酯產(chǎn)率分析

3 結論

脂肪酶在催化方面有其獨特的優(yōu)勢，但是脂肪酶受環(huán)境影響很大，從而導致催化效率不高。將分子改造運用于脂肪酶的改造中，在原始基因上通過理性設計改變某一部分或替換某一個氨基酸以此獲得突變菌株，可提高酶活和蛋白表達量。

ROL在催化生成脂肪酸酯的過程中具有良好的催化優(yōu)勢。但是產(chǎn)量和穩(wěn)定性有待提高[13]。因此本文以提高其表達量為目的，對其進行分子改造。

本文對ROL基因進行了分子改造。酶活蛋白量測量表明改造后的ROL在畢赤酵母X-33中得到了高效表達。本實驗中測得的ROL的最適溫度與pH值分別為40 ℃和8.0，在搖瓶發(fā)酵條件下酶活為1 430 U/mL。據(jù)估算，在發(fā)酵罐等高效的生物反應器條件下，通過高密度發(fā)酵酶活可再提高約10倍。