王琪，彭超，周衛(wèi)強(qiáng)，唐堂，何太波，裴成利,梁穎超，武麗達(dá)，李凡，李義，佟毅*

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；3.老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；4.中糧生物科技股份有限公司，安徽蚌埠 233010；5.玉米深加工國家工程研究中心，吉林長春 130033）

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，我國居民生活水平不斷提升，膳食結(jié)構(gòu)方面也出現(xiàn)了較大的變化，導(dǎo)致糖尿病、肥胖和心腦血管等疾病的發(fā)病率不斷攀升。國際糖尿病聯(lián)盟2017年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國擁有高達(dá)1.14億成人糖尿病患者，占世界成人糖尿病患者總數(shù)的25%以上，位居世界第一[1]。此外，近年來我國肥胖率和超重率逐年增長且均處于較高水平，張興華等[2]通過對(duì)2002—2019年采集的115個(gè)族群中6萬多名成人體質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，男性和女性超重比分別高達(dá)29.6%和30.0%，肥胖率高達(dá)11.8%和14.0%。日益升高的疾病發(fā)生率引起了人們對(duì)于飲食健康的密切關(guān)注，同時(shí)隨著人們生活品質(zhì)的提高，人們對(duì)于食物口感也有了較高的標(biāo)準(zhǔn)，尋求口感好熱量低的甜味劑逐漸成為人們的重要需求點(diǎn)。稀有糖是自然界存在的稀少單糖及其衍生物，有益于人體健康，且具備獨(dú)特功能。其中，稀有糖中的阿洛酮糖是一種低熱量甜味劑，在自然界中的含量極少，一般存在于小麥、水果和各種其他食物中。阿洛酮糖擁有70%的蔗糖甜度，熱量卻只有蔗糖的0.3%[3-4]。D-阿洛酮糖不僅甜度適中、熱量極低，還具有降血糖、抗炎、神經(jīng)保護(hù)和免疫抑制等多種藥理功效。微生物法合成D-阿洛酮糖是指在微生物菌株內(nèi)表達(dá)酮糖3-差向異構(gòu)酶，包括D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（D-psicose 3-epimerase，DPE）或D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶（D-tagatose 3-epimerase，DTE），它們以果糖作為底物進(jìn)行催化，進(jìn)而產(chǎn)生D-阿洛酮糖（圖1），因此酮糖3-差向異構(gòu)酶是微生物法合成D-阿洛酮糖的關(guān)鍵酶。本文綜述了微生物法生產(chǎn)阿洛酮糖的綠色制造工藝的研究進(jìn)展，主要包括阿洛酮糖特性及功能，生產(chǎn)阿洛酮糖關(guān)鍵酶的特性，菌株構(gòu)建、發(fā)酵生產(chǎn)工藝及分離純化和結(jié)晶工藝，以期為阿洛酮糖的后續(xù)研究和工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

圖1 果糖與阿洛酮糖異構(gòu)關(guān)系圖

1 阿洛酮糖生理功能及機(jī)制研究進(jìn)展

阿洛酮糖在緩解改善糖尿病、降血脂、保護(hù)心腦功能等方面都有重要的生理作用。PRATCHAYASAKUL等[5]研究發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖可以減輕腦氧化應(yīng)激，降低腦線粒體活性氧的產(chǎn)生及海馬細(xì)胞凋亡，改善腦胰島素不敏感性和海馬細(xì)胞突觸功能障礙，從而改善糖尿病前期大鼠的學(xué)習(xí)過程。PONGKAN等[6]開展了D-阿洛酮糖對(duì)肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠的心臟和心臟線粒體功能影響的研究，發(fā)現(xiàn)3%D-阿洛酮糖降低了大鼠體重、內(nèi)臟脂肪、血漿膽固醇，在心率變異性和減輕心臟線粒體功能障礙方面具有一定的療效，最終能夠使心臟功能得到改善。IWASAKI等[7]的研究表明D-阿洛酮糖會(huì)誘導(dǎo)胰高血糖素樣肽1受體激動(dòng)劑GLP-1釋放，進(jìn)而激活迷走神經(jīng)的傳入信號(hào)，減少食物攝入并提高葡萄糖耐量，因此阿洛酮糖可通過迷走神經(jīng)傳入來控制進(jìn)食和高血糖，從而改善暴飲暴食所致的肥胖和糖尿病。GOU等[8]研究發(fā)現(xiàn)，D-阿洛酮糖可以通過減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來調(diào)控脂聯(lián)素分泌，增強(qiáng)肌肉中的胰島素信號(hào)和Glut-4表達(dá)進(jìn)而減輕Wistar大鼠HFD誘導(dǎo)的胰島素抵抗。在改善肥胖方面，WEI等[9]研究發(fā)現(xiàn)，D-阿洛酮糖還可以通過在特定條件下促進(jìn)肌細(xì)胞的凋亡來改善肥胖，D-阿洛酮糖對(duì)C2C12（小鼠生肌細(xì)胞）沒有直接毒性，然而在低劑量H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）存在下，D-阿洛酮糖誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞損傷并以劑量依賴性方式顯著降低C2C12細(xì)胞活力，進(jìn)而使細(xì)胞凋亡水平和ROS的產(chǎn)生增加，而線粒體膜電位（MMP）降低，最終對(duì)肌肉細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。在控制脂代謝方面，HAN等[10]的研究表明5%的阿洛酮糖可以通過降低小鼠小腸中CD36、ApoB48、FATP4的mRNA表達(dá)來降低血漿和肝臟脂質(zhì)，同時(shí)升高糞便脂質(zhì)，還能夠通過脂質(zhì)調(diào)節(jié)酶活性使肝臟脂肪酸合成酶和β-氧化活性下降，使得飲食性肥胖的代謝狀態(tài)正?；EE等[11]研究阿洛酮糖對(duì)C57BL/KsJ db/db小鼠的高血糖、高胰島素血癥、糖尿病和炎癥反應(yīng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，阿洛酮糖可以顯著增加肝葡萄糖激酶的活性，降低肝磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的活性。此外，D-阿洛酮糖還能有效降低血漿和肝內(nèi)的甘油三酸酯和游離脂肪酸水平，降低肝脂肪酸氧化和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性，降低血漿中促炎性脂肪因子和細(xì)胞因子的水平等方式來綜合改善脂質(zhì)和糖代謝。綜上，阿洛酮糖主要是作為激活劑等引發(fā)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而對(duì)脂代謝和血糖代謝通路等起到一定的調(diào)控作用。

2 阿洛酮糖的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)述

D-阿洛酮糖的制備方法主要包括了生物轉(zhuǎn)化法和化學(xué)法等。其中，化學(xué)法是通過環(huán)轉(zhuǎn)換合成法、催化加氫法和加成反應(yīng)法等化學(xué)手段來制備阿洛酮糖的方法，此類方法成本高且立體選擇性較差，具有一定的化學(xué)污染，因此應(yīng)用受限。利用一種或多種酶催化底物生成目標(biāo)產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化法由于具有反應(yīng)條件溫和、低毒環(huán)保、環(huán)境相容性好等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)成為目前阿洛酮糖合成的主流方式。生物法生產(chǎn)阿洛酮糖的工藝主要涵蓋了D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶基因挖掘與篩選、用于生產(chǎn)D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的工程菌株構(gòu)建、菌株的發(fā)酵優(yōu)化及擴(kuò)大培養(yǎng)、所得菌株中酶的提取分離、酶促反應(yīng)將果糖轉(zhuǎn)化成D-阿洛酮糖、D-阿洛酮糖的分離純化以及產(chǎn)物結(jié)晶，最終得到高純度的阿洛酮糖晶體。其中，菌株構(gòu)建與酶的表達(dá)、產(chǎn)物分離純化及結(jié)晶等是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，阿洛酮糖的具體生產(chǎn)工藝流程如圖2所示。

圖2 生物法合成阿洛酮糖的工藝流程

2.1 阿洛酮糖生產(chǎn)相關(guān)酶的來源與性質(zhì)

酮糖3-差向異構(gòu)酶（KE）可逆催化酮糖之間的差向異構(gòu)化，將酮糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖，因此是生物法生產(chǎn)阿洛酮糖的有效工具。目前不同微生物來源常用酶根據(jù)底物的不同主要分為D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了來自不同菌株的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶（如表1所示）[12-18]。

表1 不同來源的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶性質(zhì)的比較

由表1可以看出，兩種酮糖3-差向異構(gòu)酶大多依賴于金屬離子Co2+和Mn2+，Co2+離子適宜pH一般在7.5～8.0，適宜溫度在50～70℃，Mn2+離子適宜pH一般在7.5～8.5，適宜溫度在35～55℃，且對(duì)D-果糖具有良好的催化活性。WANG等[16]開發(fā)的Escherichia coli來源的金屬依賴性酶是為數(shù)不多的對(duì)Ni2+顯示出最高活性的酶，較低濃度的Ni2+能夠使酶提高耐熱性。該酶表現(xiàn)出較為寬泛的pH和溫度范圍，在pH值為6.0、溫度為50 ℃條件下活性最大，達(dá)到30%的轉(zhuǎn)化率。QI等[15]發(fā)現(xiàn)的R. sphaeroide來源阿洛酮糖差向異構(gòu)酶在低溫下催化反應(yīng)效果最好，最佳溫度為35 ℃，而當(dāng)溫度＞40 ℃時(shí)活性開始下降。而PATEL等[17]開發(fā)的差向異構(gòu)酶在高溫（75～80 ℃）時(shí)表現(xiàn)出最佳的催化效果，在最佳條件下，700 mg/mL D-果糖的酶促處理能產(chǎn)生約217 mg/L的D-阿洛酮糖。工業(yè)生產(chǎn)中阿洛酮糖高產(chǎn)需要高酶活的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，因此開發(fā)高催化活性的酶仍然是現(xiàn)階段的難點(diǎn)。

2.2 阿洛酮糖差向異構(gòu)酶生產(chǎn)工程菌株的表達(dá)體系

目標(biāo)酶的表達(dá)離不開宿主菌體，將所發(fā)掘的不同來源的阿洛酮糖異構(gòu)酶基因序列片段連接到載體上，再將載體導(dǎo)入到宿主菌株中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，才能實(shí)現(xiàn)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的表達(dá)，因此發(fā)酵菌株的構(gòu)建及酶表達(dá)是生物法生產(chǎn)阿洛酮糖工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。阿洛酮糖差向異構(gòu)酶生產(chǎn)中常見的表達(dá)體系主要包括枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和酵母菌。

2.2.1 枯草芽孢桿菌表達(dá)體系

枯草芽孢桿菌是自然界中廣泛存在的一種產(chǎn)芽孢革蘭氏陽性菌，其安全性好，既不含內(nèi)毒素也不分泌外毒素，被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)定為生物安全菌株?？莶菅挎邨U菌由于具備一定的蛋白分泌能力，在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中常被用來生產(chǎn)異源蛋白，且在α-淀粉酶、β-甘露聚糖酶、人類白介素-3和脂肪酶等產(chǎn)品生產(chǎn)上已經(jīng)獲得突破[18-19]。目前，枯草芽孢桿菌也常被用于表達(dá)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的菌株載體，且已有諸多枯草芽孢桿菌表達(dá)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的相關(guān)研究。賈敏等[20]將利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增后的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因與枯草芽孢桿菌載體pMA5連接，構(gòu)建出重組質(zhì)粒，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，WB800）感受態(tài)細(xì)胞中經(jīng)篩選鑒定得到了D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶重組菌株。研究表明，該菌株產(chǎn)生阿洛酮糖差向異構(gòu)酶最適pH為7.0，其中最適溫度為55 ℃，18 h時(shí)酶活可達(dá)6.8 U/mL。溫宇威等[21]以枯草芽孢桿菌為宿主，在克隆了D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因后，將基因的上游加入了P43啟動(dòng)子,再將形成的特定基因序列連接到pMA5載體上構(gòu)建出雙啟動(dòng)子表達(dá)DPE家族酶的表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組高效表達(dá)的DPE的最適溫度為55 ℃，最適pH為7.0，在溫度30～40 ℃和pH 6.5～7.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性好，以D-阿洛酮糖為底物對(duì)應(yīng)的Km為26.68 mmol/L，催化效率 Kcat/Km為 95.8 L/（mmol·min）。CHEN 等[22]將瘤胃球菌屬的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶在枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)，在比較3種糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子后，發(fā)現(xiàn)了木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PxylA生產(chǎn)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶是最有效的啟動(dòng)子?；谡T導(dǎo)物濃度和阿洛酮糖差向異構(gòu)酶表達(dá)的分析，推測(cè)細(xì)胞內(nèi)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶表達(dá)與木糖積累水平間的相關(guān)性，在經(jīng)過分析優(yōu)化后將最佳木糖誘導(dǎo)濃度從4.0%降低到0.5%，此時(shí)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶在7.5 L發(fā)酵罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵的表達(dá)水平達(dá)到了95 U/mL和2.6 g/L。孫帆等[23]對(duì)來源于解纖維素梭菌的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶基因在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行產(chǎn)酶活性研究，發(fā)現(xiàn)在3 L發(fā)酵體系中高密度發(fā)酵的終點(diǎn)酶活可高達(dá)495 U/mL，得到高表達(dá)量阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的發(fā)酵液，以硅藻土-海藻酸鈉為材料對(duì)發(fā)酵液的重組細(xì)胞進(jìn)行固定化研究，發(fā)現(xiàn)連續(xù)反應(yīng)多批次后轉(zhuǎn)化率仍然為28%，且可保持殘余酶活為81%。FU等[24]從瘤胃球菌中克隆了D阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，并在枯草芽孢桿菌A311中表達(dá)。發(fā)酵調(diào)控方法采用兩步pH分段調(diào)節(jié)方法，即發(fā)酵前24 h維持發(fā)酵液pH值為7.0，后24 h維持pH值為7.5，該方法顯著提高了阿洛酮糖差向異構(gòu)酶產(chǎn)量并降低了發(fā)酵成本，結(jié)果表明阿洛酮糖差向異構(gòu)酶產(chǎn)量為74 U/mL，是對(duì)照組的2.5倍。綜上，枯草芽孢桿菌-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶構(gòu)建及表達(dá)體系日趨成熟，菌株的構(gòu)建方法及發(fā)酵的調(diào)控方式呈現(xiàn)多樣化，表達(dá)的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶均維持在較高水平。

2.2.2 大腸桿菌表達(dá)體系

大腸桿菌不但成本低廉、繁殖較快，而且外源蛋白的表達(dá)量較高，同時(shí)也具備了利于同位素標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用以及適用范圍廣等諸多優(yōu)勢(shì)，因此常被應(yīng)用于外源蛋白表達(dá)研究。目前，大腸桿菌被用于阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的載體表達(dá)的研究已取得一定的進(jìn)展，周衛(wèi)強(qiáng)等[25]對(duì)異源表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶工程大腸桿菌在5 L罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并系統(tǒng)探究了該菌株表達(dá)D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的誘導(dǎo)工藝，結(jié)果表明誘導(dǎo)后溫度25 ℃、pH 7.0、IPTG誘導(dǎo)劑濃度0.5 mmol/L為發(fā)酵工藝的最優(yōu)條件，發(fā)酵所得阿洛酮糖差向異構(gòu)酶在酶促反應(yīng)30 min平衡轉(zhuǎn)化率可達(dá)28%左右。PARK等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在Terrific Broth（TB）培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌細(xì)胞24 h時(shí)，表達(dá)來自根癌農(nóng)桿菌的雙位點(diǎn)變體（I33LS213C）D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的比活性較高，24 h后重組大腸菌株中粗蛋白和阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的表達(dá)含量分別為37.0%和8.6%。通過研究發(fā)現(xiàn)重組大腸菌株在60 ℃、pH 8.5、細(xì)胞濃度為4 g/L和果糖700 g/L條件下最有利于用D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖，大腸菌株酶促反應(yīng)40 min可產(chǎn)生230 g/L D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率為33%，容積生產(chǎn)率為345 g/（L·h），比生產(chǎn)率為86.2 g/（g·h）。袁堂國等[27]構(gòu)建了異源表達(dá)Flavonifractor plautiiD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組大腸桿菌用于轉(zhuǎn)化果糖，以實(shí)現(xiàn)D-阿洛酮糖的全細(xì)胞生物合成。結(jié)果表明，pH 7.5、65 ℃為重組菌株酶解反應(yīng)最優(yōu)條件，且在不添加金屬離子時(shí)，半衰期達(dá)到2.7 h；D-果糖水溶液中加入濃度為2.4 g/L菌液反應(yīng)，所得D-阿洛酮糖的濃度為231 g/L，轉(zhuǎn)化率可達(dá)33%，在體系額外加入硼酸根離子后，D-阿洛酮糖終濃度可提升至378 g/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)63%。溫俊婷等[28]嘗試在大腸桿菌Rosetta（DE3）體系中分別過表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶、L-鼠李樹膠糖激酶（RhaB）和多聚磷酸鹽激酶（PPK）,并將3種酶偶聯(lián)生產(chǎn)阿洛酮糖并計(jì)算產(chǎn)率。結(jié)果顯示，將DPE和RhaB雙酶偶聯(lián)反應(yīng)，在pH 8.5、溫度35 ℃，DPE和RhaB酶量比為1∶2，且加入微量Mg2+條件下反應(yīng)最優(yōu)，此條件下的阿洛酮糖得率可高達(dá)70%；將DPE、RhaB和PPK 3酶偶聯(lián)進(jìn)行反應(yīng)，ATP濃度降低80%，反應(yīng)成本得到進(jìn)一步降低，但D-阿洛酮糖得率僅為50%。綜上，大腸桿菌易遺傳改造且便于發(fā)酵培養(yǎng)，是目前生產(chǎn)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶等的重要宿主菌株，通過代謝工程策略的不斷研究會(huì)更加理性地改造大腸桿菌菌株，這將為生物法高效生產(chǎn)阿洛酮糖提供更新的工藝。

2.2.3 酵母菌表達(dá)及催化體系

酵母表達(dá)系統(tǒng)有眾多品質(zhì)優(yōu)良的宿主菌株，其不僅經(jīng)濟(jì)節(jié)約、耐熱性優(yōu)異，且能利用多種能源物質(zhì)，還能快速提高密度并產(chǎn)生蛋白。隨著研究的不斷深入，酵母菌株也逐漸被應(yīng)用于阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的表達(dá)場(chǎng)所或是提供D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶催化的場(chǎng)所。朱星星等[29]采用基因工程手段將連有D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的載體在馬克斯克魯維酵母工程菌株中高效表達(dá)，并進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng)條件優(yōu)化及酶學(xué)特性研究，研究表明濃度為10 g/L的馬克斯克魯維酵母菌株最優(yōu)催化條件為溫度55 ℃、pH 8.0，此條件下可將750 g/L的D-果糖催化產(chǎn)生190 g/L的D-阿洛酮糖。LI等[30]利用釀酒酵母孢子固定了來源于嗜熱細(xì)菌和根癌農(nóng)桿菌的木糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，接著在孢子固定化酶的催化作用下完成從底物D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化，最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到12.0%。綜上，酵母菌不僅在表達(dá)阿洛酮糖異構(gòu)酶上具有一定優(yōu)勢(shì)，作為進(jìn)行下游酶促反應(yīng)的場(chǎng)所來固定酶也可以實(shí)現(xiàn)阿洛酮糖的高產(chǎn)。

2.3 阿洛酮糖的分離純化

通過菌株發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)得到的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，以果糖作為底物，在一定的反應(yīng)條件下通過對(duì)果糖異構(gòu)化的催化反應(yīng)從而得到D-阿洛酮糖。但由于阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶催化果糖的異構(gòu)化反應(yīng)屬于可逆反應(yīng)，化學(xué)反應(yīng)平衡時(shí)仍混有果糖，因此需要進(jìn)一步進(jìn)行阿洛酮糖的分離純化。但阿洛酮糖和果糖這兩種糖互為差向異構(gòu)體，其物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)十分相近，因此分離難度很大，目前常采用色譜分離法進(jìn)行分離，其中主要包括離子交換樹脂和模擬移動(dòng)床色譜等。

（1）模擬移動(dòng)床分離具有自動(dòng)化程度高、分離效率高、操作費(fèi)用小等優(yōu)勢(shì)，常用于糖工業(yè)的分離。如任世闊等[31]通過移動(dòng)床色譜對(duì)混有葡萄糖、果糖及低聚糖的糖混合液進(jìn)行分離，獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于80%的阿洛酮糖溶液。冉淦僑等[32]利用D-果糖與固定化D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶納米微球反應(yīng)，制備D-阿洛酮糖與果糖的混合液，在脫色預(yù)處理后將混合液按照順序式模擬移動(dòng)床的特定分離參數(shù)進(jìn)行分離，得到的D-阿洛酮糖溶液的純度超過99%，回收率超過95%。由此可見模擬移動(dòng)床分離效率高，有助于阿洛酮糖的連續(xù)化生產(chǎn)。

（2）離子交換樹脂操作簡(jiǎn)便、分離速度快，不使用有毒有害的有機(jī)萃取劑及溶劑，性能穩(wěn)定、可反復(fù)使用，因此也被應(yīng)用于阿洛酮糖的分離。LI等[33]使用葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖氧化酶以果糖作為底物進(jìn)行分步酶催化反應(yīng)，在阿洛酮糖和果糖的混合糖液中的果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸后，利用離子交換樹脂將葡萄糖酸分離出去，最終得到純度為91.2%的阿洛酮糖。邢慶超等[34]采用陰（陽）離子交換樹脂將生物法得到的D-阿洛酮糖進(jìn)行脫色脫鹽，接著采用DTF-Ca2+型離子交換樹脂進(jìn)行后續(xù)分離純化，研究發(fā)現(xiàn)柱溫為60 ℃、進(jìn)樣量為10 mL、流速為1 mL/min時(shí)分離效果最佳，經(jīng)液相色譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)分離產(chǎn)物中D-阿洛酮糖純度可達(dá)98.3%。

（3）還可以利用生物發(fā)酵法純化阿洛酮糖。釀酒酵母在有氧環(huán)境下能夠以混合糖液中的D-葡萄糖或D-果糖為能量來源生成二氧化碳，同時(shí)對(duì)D-阿洛酮糖含量沒有明顯影響，汪俊卿等[35]依據(jù)此原理開發(fā)出一種提高混合糖液中阿洛酮糖含量的方法，該方法既能夠除去D-葡萄糖和D-果糖，又能除掉阿洛酮糖加熱濃縮中產(chǎn)生的色素，大幅提高了阿洛酮糖的純度。

2.4 阿洛酮糖結(jié)晶工藝

經(jīng)分離純化后的阿洛酮糖經(jīng)過干燥結(jié)晶工藝才能得到易于貯藏的阿洛酮糖晶體，受熱的阿洛酮糖易發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，因此結(jié)晶難度較大，難以通過加熱干燥等方式制得干品，是目前制約阿洛酮糖在貯存運(yùn)輸方面的關(guān)鍵問題。郭元亨等[36]嘗試在乙醇體系中優(yōu)化阿洛酮糖的結(jié)晶，研究發(fā)現(xiàn)在D-阿洛酮糖溶液密度為1.35 g/mL、D-阿洛酮糖溶液與乙醇比例為1.0∶3.8、結(jié)晶時(shí)間325 min、結(jié)晶溫度25 ℃的結(jié)晶條件下對(duì)阿洛酮糖進(jìn)行初次結(jié)晶，收率可達(dá)71.58%。在常規(guī)的結(jié)晶工藝中，阿洛酮糖溶液飽和濃度高、黏度大，導(dǎo)致結(jié)晶困難、晶型細(xì)小、晶體分布不集中以及阿洛酮糖收率較低等問題。杜倩等[37]采用蒸發(fā)結(jié)晶法和降溫結(jié)晶法相結(jié)合的阿洛酮糖結(jié)晶方法，依次經(jīng)過蒸發(fā)結(jié)晶、整晶與降溫結(jié)晶過程最終制備得到了阿洛酮糖晶體，其晶體目數(shù)分布集中，且80%以上的晶體尺寸均在40～60目。目前，阿洛酮糖結(jié)晶工藝較為煩瑣，如何將工藝化繁為簡(jiǎn)，減少有機(jī)試劑添加量，進(jìn)一步提高阿洛酮糖結(jié)晶度，獲得大小形狀合適的晶體，將是提高阿洛酮糖晶體純度的關(guān)鍵，因此結(jié)晶工藝仍有很大的瓶頸需要突破。

3 結(jié)語

隨著生活品質(zhì)的提高，人們對(duì)于健康飲食的關(guān)注度日益增大，我國人口基數(shù)龐大，對(duì)于功能糖產(chǎn)品的需求量很高，因此阿洛酮糖具有很大的市場(chǎng)開發(fā)潛力。但目前阿洛酮糖的生產(chǎn)技術(shù)仍存在一些技術(shù)壁壘，較難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，其主要原因有以下幾點(diǎn)：（1）差向異構(gòu)酶活較低，要加大菌株研發(fā)力度，構(gòu)建出穩(wěn)定產(chǎn)出高酶活值的菌株，阿洛酮糖結(jié)晶難度大，目前結(jié)晶相關(guān)的研究，突破難度大；（2）阿洛酮糖的生產(chǎn)大多以果糖為底物，果糖成本較高，開發(fā)低廉的菌株發(fā)酵配方將有助于降低阿洛酮糖的工業(yè)生產(chǎn)成本；（3）我國阿洛酮糖法規(guī)申報(bào)工作滯后，市場(chǎng)拓展方面有欠缺。相信隨著國家對(duì)阿洛酮糖生理功能研究和臨床試驗(yàn)探索的逐步深入以及法規(guī)申報(bào)制度的日益完善，阿洛酮糖生產(chǎn)工藝會(huì)得到進(jìn)一步的提升，它將逐漸走入人們的生活，走上百姓的餐桌。