周曉馥，劉美琦，金妍，徐洪偉*

(1.吉林師范大學 生命科學學院，吉林 四平 136000；2.吉林師范大學 吉林省植物資源科學與綠色生產(chǎn)重點實驗室，吉林 四平 136000)

0 引言

玉米(ZeamaysL.)占據(jù)世界糧食總產(chǎn)量的第一位，同時玉米也是重要的工業(yè)原料及飼料.但實際生產(chǎn)中玉米會因受到諸多不利因素導致產(chǎn)量大大降低，如干旱、低溫、鹽脅迫等[1].MYB轉錄因子是植物中最大的一類轉錄因子家族，MYB蛋白在抵抗非生物脅迫調控中有重要作用.對玉米MYB轉錄因子家族進行功能分類和分析鑒定，可為玉米MYB轉錄因子家族蛋白的抗旱功能研究奠定基礎，為研究玉米MYB轉錄因子家族蛋白應答干旱脅迫提供重要借鑒.MYB轉錄因子，在植物中家族成員數(shù)量較多，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(ZeamaysL.)和水稻(OryzasativaL.)中MYB類轉錄因子各有168、203和130個[2].MYB轉錄因子家族成員都具有高度保守的MYB結構域.通常根據(jù)其所包含的MYB結構域的重復數(shù)量將MYB類轉錄因子分為MYB-related、R2R3-MYB(2R-MYB)、3R-MYB和4R-MYB四類，R2R3-MYB類蛋白在其N端含有DNA結合結構域，C端含有激活或抑制結構域，其參與植物生長發(fā)育、代謝、脅迫以及代謝等生理機制的調節(jié)[3-4].目前MYB轉錄因子家族已被證明參加了植物對干旱的應答[5]，研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎麥中的FtMYB9過表達可以提高轉基因擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性[6]，苦蕎麥FtMYB13可以提高擬南芥的耐鹽和耐旱性[7]，大麥轉錄因子HvMYB1是耐旱性的正調控因子[8]，玉米MYB轉錄因子ZmMYB3R的表達可以提高轉基因植株的干旱和鹽脅迫耐受性[9]，楊樹中的PtrMYB94與ABA信號協(xié)同作用，可以提高植物的抗旱性[10].由于玉米作為人類賴以生存的重要糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質受種植區(qū)域干旱脅迫的影響較為嚴重.通過挖掘應答干旱脅迫的玉米MYB轉錄因子，分析其蛋白結構，可為揭示玉米抗旱功能分析奠定基礎.本研究通過對玉米和擬南芥中具有抗脅迫功能的MYB家族成員構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，進而預測玉米中與抗旱功能有關的MYB轉錄因子，為闡明玉米轉錄因子MYB家族應對干旱脅迫的功能奠定一定基礎.

1 材料和方法

1.1 玉米MYB轉錄因子的獲取和鑒定

從植物轉錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB(planttfdb.gao-lab.org)上搜索玉米MYB轉錄因子，并下載所有的氨基酸序列.隨后使用Pfam(http：//pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫進行MYB結構域的識別，將得到的玉米MYB轉錄因子分類并匯總記錄.擬南芥的R2R3-MYB和MYB-related成員主要從TAIR數(shù)據(jù)庫中下載獲得.

1.2 玉米MYB蛋白理化性質分析

從植物轉錄因子數(shù)據(jù)庫中獲得玉米MYB蛋白的理化性質，包括氨基酸(aa)、相對分子質量(MW)、等電點(PI)、功能等信息.

1.3 玉米MYB轉錄因子的保守基序預測

為了研究蛋白序列中除MYB重復以外的保守基序，利用MEME在線軟件(http：//memsuite.org/index.html)分析玉米MYB蛋白全長序列，隨后用TBtools軟件進行保守基序可視化分析.

1.4 玉米MYB轉錄因子蛋白結構域分析

為了研究玉米MYB轉錄因子抗旱蛋白的結構域，基于玉米具有抗旱功能的MYB轉錄因子蛋白全長序列，通過TBtools軟件進行蛋白結構域可視化分析.

1.5 玉米MYB轉錄因子蛋白亞細胞定位

對玉米MYB轉錄因子抗旱蛋白進行亞細胞定位，使用ProtComp進行分析，獲得相應的蛋白質定位結果.

1.6 玉米MYB轉錄因子蛋白質二級和三級結構預測

利用SOPMA在線軟件預測玉米MYB轉錄因子抗旱蛋白質的二級結構，利用SWISS-MODLE對其進行三級結構預測.

1.7 玉米MYB轉錄因子的功能預測

為了預測玉米MYB轉錄因子蛋白的功能，采用MUSCLE對玉米MYB序列與擬南芥MYB序列進行多序列比對，借助于MEGA11.0軟件將玉米MYB轉錄因子蛋白與擬南芥MYB轉錄因子蛋白進行系統(tǒng)進化樹的構建.

2 結果與討論

2.1 玉米MYB轉錄因子鑒定

利用PlantTFDB數(shù)據(jù)庫，通過關鍵詞“MYB”和“Zeamays”獲得203個玉米MYB轉錄因子，如表1所示.依據(jù)MYB結構域重復數(shù)目的不同，將其分為五類：MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB及5R-MYB.其中，數(shù)量最多的是R2R3-MYB類，有176個，占總數(shù)的86.7%.根據(jù)玉米MYB轉錄因子家族的命名方法，命名為Zm2RMYB1-Zm2RMYB176.其次為MYB-related類，有20個，命名為Zm1RMYB1-Zm1RMYB20.3R-MYB類有6個，命名為Zm4RMYB1-Zm4RMYB6.5R-MYB類只有1個，命名為Zm5RMYB1.為了解玉米MYB蛋白的特點，分析了玉米MYB的蛋白理化性質，結果如表1所示：玉米MYB蛋白編碼188～1 060個氨基酸；玉米MYB蛋白家族的相對分子質量在20 693.7～117 692 kD之間；玉米MYB蛋白家族的等電點在4.297 7～12.297 4之間.

表1 玉米MYB轉錄因子的分類及性質

2.2 玉米MYB轉錄因子的保守基序分析

為了解玉米MYB轉錄因子的進化關系，構建了玉米203個MYB轉錄因子的進化樹，如圖1所示.玉米MYB轉錄因子R2R3-MYB類聚在一起，其中有少數(shù)的MYB-related類與R2R3-related類聚集在一起.為進一步了解玉米MYB蛋白結構，通過在線軟件MEME對玉米MYB蛋白的保守基序進行預測，利用TBtools 軟件獲得結果圖2.由圖可知，玉米的四類MYB轉錄因子中存在的Motif有差異，通常同一類MYB轉錄因子中Motif的分布情況較相似.R2R3-MYB 類蛋白均共享Motif 1、Motif 3、Motif 4、Motif 5、Motif6和Motif 8.3R-MYB類蛋白均共享Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 10.5R-MYB類蛋白中含有3個Motif 1.MYB-related類蛋白均含有Motif 2和Motif 3.在R2R3-MYB類蛋白中，Motif在每個基因上的相對位置是一致的，說明Motif并非隨機出現(xiàn)，而是具有一定的保守性.

圖1 玉米MYB轉錄因子進化樹

圖2 玉米MYB轉錄因子的保守基序

2.3 玉米MYB轉錄因子的功能預測

為對玉米MYB轉錄因子進行功能預測，將176個R2R3-MYB類轉錄因子和20個MYB-related類轉錄因子分別與擬南芥MYB轉錄因子進行多序列對比，利用MAGE11.0構建進化樹得到結果圖3和圖4.根據(jù)擬南芥R2R3-MYB類轉錄因子劃分的功能群，對玉米R2R3-MYB類轉錄因子的功能進行預測，玉米R2R3-MYB類轉錄因子可能與植物細胞的發(fā)育、植物雄性生殖器和莖的發(fā)育、植物苯丙烷類次生代謝途徑的調節(jié)、植物非脅迫調節(jié)有關.以擬南芥MYB-related類轉錄因子的分類為依據(jù)，部分擬南芥中的轉錄因子在玉米中沒有發(fā)現(xiàn).由此可知，R2R3-MYB類蛋白在植物生長發(fā)育過程發(fā)揮作用，且不同物種中MYB-related類的蛋白在進化過程中具有一定的差異性.

圖3 玉米與擬南芥R2R3-MYB類蛋白的進化樹

圖4 玉米與擬南芥MYB-related類蛋白的進化樹

2.4 玉米MYB轉錄因子家族抗旱蛋白成員的鑒定

在玉米中共鑒定出203個MYB成員，其中102個MYB成員有明確的結構功能，101個MYB成員功能未知.根據(jù)功能篩選，玉米MYB成員中具有抗旱功能的蛋白有16個(如表2).16個MYB具有抗旱功能的蛋白質長度介于225～563 aa；相對分子質量大小25 246.7～61 659.3 kD；PI介于4.625 4～10.776 1.

表2 玉米MYB抗旱蛋白的性質

2.5 玉米MYB轉錄因子家族抗旱蛋白的亞細胞定位分析

運用ProtComp對玉米MYB抗旱蛋白進行亞細胞定位，結果顯示玉米MYB抗旱蛋白均集中定位于細胞核上.

2.6 玉米MYB轉錄因子家族抗旱蛋白保守基序分析

本研究在玉米MYB抗旱成員中共鑒定到10個保守基序，大部分玉米MYB抗旱成員都含有 Motif 1 和 Motif 9 (如圖5).R2R3-MYB類具有抗旱功能的蛋白所含保守基序種類最少.此外，本研究還發(fā)現(xiàn)一些特有的基序，如Motif 2、Motif 3、Motif 5、Motif 6、Motif 7、Motif 8和Motif 10為Zm3RMYB1-Zm3RMYB6所特有，且Motif的排列位置大概是相同的，并非隨機出現(xiàn)，而是具有一定的保守性.

2.7 玉米MYB轉錄因子家族抗旱蛋白結構域分析

利用TBtools軟件分析了16個玉米MYB抗旱蛋白結構域，由圖6可知，所有的玉米MYB蛋白均含有SANT結構域，其中最復雜的結構域出現(xiàn)在Zm2RMYB8 成員(含有2個SANT結構域和5個LCR區(qū)域)，屬于MYB轉錄因子家族中典型的R2R3-MYB型.最簡單的結構域出現(xiàn)在 Zm2RMYB171成員(僅含有 SANT結構域).其中，Zm3RMYB1-Zm3RMYB6的結構域排布較為整齊，均含有3個SANT結構域，屬于MYB轉錄因子家族中典型的R3-MYB型.

圖5 玉米MYB抗旱蛋白的保守基序

圖6 玉米MYB抗旱蛋白結構域

2.8 玉米MYB轉錄因子家族抗旱蛋白二級和三級結構預測分析

利用SOPMA在線軟件預測玉米轉錄因子抗旱蛋白的二級結構，結果如表3所示，玉米MYB抗旱蛋白結構以無規(guī)則卷曲(Cc，random coil)和α螺旋(Hh，alpha helix)為主，并且同時包含部分的β折疊(Tt，beta turn)和延伸鏈(Ee，extended strand).三級結構的預測結果顯示(如圖7)，玉米MYB轉錄因子抗旱蛋白結構與二級結構預測結構較為接近，符合預測結果.其無規(guī)則卷曲占比較大，此類結構對蛋白功能的發(fā)揮有極其重要的作用.

表3 玉米MYB轉錄因子抗旱蛋白二級結構特征預測

圖7 玉米MYB轉錄因子抗旱蛋白三級結構預測

續(xù)圖7

2.9 玉米MYB轉錄因子的功能預測及進化樹分析

利用101個玉米MYB轉錄因子家族未知功能蛋白的全長序列與已報道過具有明確功能的擬南芥MYB蛋白(如表4)共同構建了系統(tǒng)進化樹(如圖8)，更好地定位到與抗旱有關的玉米MYB蛋白[11].進化樹顯示，48個玉米MYB蛋白與擬南芥MYB具有抗旱功能的蛋白親緣關系較近，表明這48個MYB蛋白可能與玉米抵抗干旱脅迫功能有關.

表4 擬南芥參與非生物脅迫的MYB轉錄因子

圖8 玉米MYB未知功能蛋白與擬南芥MYB類蛋白的進化樹

植物時常處于限制其生長發(fā)育的環(huán)境條件下，干旱脅迫是嚴重影響植物生長的環(huán)境因素之一[12].由于玉米作為人類賴以生存的重要糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質受種植區(qū)域干旱脅迫的影響較為嚴重[13].MYB是真核生物中廣泛存在的一類轉錄因子，其家族廣泛參與機體生長發(fā)育、生物脅迫應答及非生物脅迫應答等過程[14-17]，因此研究玉米MYB轉錄因子家族蛋白應答干旱脅迫具有十分重要的意義.

擬南芥中MYB轉錄因子的功能研究較為透徹，AtMYB12、AtMYB75通過調節(jié)擬南芥中黃酮類物質的含量來適應干旱、高鹽的環(huán)境，AtMYB60通過調控氣孔關閉和根的生長來適應干旱環(huán)境，AtMYB96通過整合ABA和生長素信號來增強抵抗干旱脅迫的能力，AtMYB15在低溫脅迫下，其表達量升高，AtMYB14通過調節(jié)CBFs的表達來參與抵抗低溫環(huán)境，AtMYB2、AtMYB73通過參與一系列調節(jié)途徑應對高鹽脅迫環(huán)境，AtMYB4、AtMYB7、AtMYB32通過抑制苯丙烷各代謝分支途徑基因的表達來抵抗紫外線脅迫[11].有學者認為可依據(jù)進化樹中與擬南芥的親緣關系預測研究物種蛋白的功能[18].本研究運用生物信息學的方法，對從玉米中獲得203個MYB轉錄因子蛋白序列進行了理化性質、保守基序、蛋白結構域、亞細胞定位、結構預測、功能預測、系統(tǒng)進化等多方面分析，對其理化性質和蛋白結構等有了較全面的認識[19-24].

3 結論

通過對玉米MYB轉錄因子提交至Pfam在線軟件進行分析，依據(jù)MYB結構域重復數(shù)量，將玉米MYB進行分類，共分為MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB及5R-MYB五類.根據(jù)對玉米MYB轉錄因子保守基序的分析，同一類家族成員具有相似的Motif且位置相同.根據(jù)PlantTFDB數(shù)據(jù)庫所得的101個無明確功能的玉米MYB類轉錄因子編碼蛋白與11個功能明確的擬南芥MYB類轉錄因子編碼蛋白作系統(tǒng)進化樹，證明了相鄰或較近進化關系上的48個玉米MYB蛋白可能具有相同或相似的功能.

綜上所述，本研究基于玉米MYB轉錄因子蛋白數(shù)據(jù)，通過分析玉米MYB轉錄因子的保守基序、蛋白結構域、亞細胞定位、結構預測和進化關系，較為系統(tǒng)地鑒定了玉米MYB轉錄因子家族.其中明確具有抗旱功能的蛋白有16個，未知功能的蛋白中有48個玉米MYB轉錄因子與擬南芥中主要參與抗旱的MYB轉錄因子存在較近的親緣關系，推測可能與玉米抵抗干旱脅迫相關.本研究為玉米抵抗干旱脅迫的功能提供了一定的理論基礎，具有重要意義.