寧煥宸，吳夢君，趙惠新，劉會強＊

（1.新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學(xué)自治區(qū)重點實驗室，新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，湖北 武漢 430032）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）廣泛分布在土壤及腐敗有機物中，具有生長速度快、對營養(yǎng)要求低、易培養(yǎng)、可拮抗真菌等特點，在分解生產(chǎn)廢料、降解環(huán)境污染物、進行生物防治等方面已有應(yīng)用［1-5］。據(jù)報道，一些枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生伊枯草菌素和短桿菌肽等脂肽類物質(zhì)，對多種病原菌及條件致病真菌有高效拮抗作用［6-8］，有些芽孢桿菌所產(chǎn)生的多種酶［9-12］以及天然活性產(chǎn)物［13-17］，可作為農(nóng)業(yè)飼料添加劑和水體凈化劑［18-20］，這些代謝產(chǎn)物還可以提升動物體免疫水平［21］。近年來，枯草芽孢桿菌已成為生防菌和發(fā)酵工業(yè)工程菌的篩選菌種資源菌種［22-27］。

BS-Z15是分離于新疆棉花根際土壤的枯草芽孢桿菌，該菌發(fā)酵產(chǎn)物具有高效、穩(wěn)定的廣譜抗真菌特性，可以有效拮抗大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）［28-29］，具有巨大的生物防治棉花黃萎病潛力。有研究發(fā)現(xiàn)，不同亞種的枯草芽孢桿菌對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的需求和利用率存在差異［30-32］，其中，碳源、氮源和無機鹽的種類和濃度是培養(yǎng)基中重要的發(fā)酵原料。篩選獲得適合BS-Z15 高效發(fā)酵的優(yōu)化培養(yǎng)基，是利用其發(fā)酵產(chǎn)物進行黃萎病防治等生產(chǎn)應(yīng)用的前提要求。本研究在前期明確了枯草芽孢桿菌BS-Z15在發(fā)酵18小時后產(chǎn)生抗真菌活性物質(zhì)較多的基礎(chǔ)上，以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為對照，以O(shè)D600nm吸光值讀數(shù)作為菌體生長濃度指標(biāo)，以發(fā)酵產(chǎn)物濃縮后對大麗輪枝菌抑菌圈直徑為抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量指標(biāo)，比較不同氮源、碳源和無機鹽對枯草芽孢桿菌BS-Z15 菌體生長和抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響，篩選最優(yōu)氮源、碳源和無機鹽，并利用響應(yīng)面法分析并優(yōu)化三者濃度配比，為提升枯草芽孢桿菌BS-Z15的發(fā)酵效率奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BS-Z15：由新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室分離、鑒定、保存。

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）：Verticillium dahliae 991（以下簡稱Vd）由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。參照文獻［32］方法制備Vd孢子并制備雙層板，置于4℃冰箱備用。

所有試劑均購自北京奧博星試劑公司，為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 BS-Z15拮抗大麗輪枝菌發(fā)酵產(chǎn)物制備

以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NB）為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，參照趙君潔［33］等提出的方法進行液體培養(yǎng)BS-Z15 18小時（37℃，180rpm），檢測菌液OD600nm，并采用酸沉淀及正丁醇抽提法獲得抗真菌活性產(chǎn)物粗提物，將來源于100mL發(fā)酵液的粗提物溶解在0.5mL去離子水中備用，進一步采用雙層板法［33］檢測抗真菌活性，用于反映抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量。

1.2.2 最適碳源、氮源、無機鹽篩選

分別用3.0g/L 的葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、玉米粉、甘露醇、淀粉、山梨醇替換牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的牛肉膏，其余成分不變，制備培養(yǎng)基并進行BS-Z15 發(fā)酵，對比不同碳源對BS-Z15 生長及產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的影響，篩選最優(yōu)碳源；分別以10.0g/L 的尿素、硫酸銨、硝酸銨、酵母浸粉、硝酸鉀等替換牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的蛋白胨，其余成分不變，制備培養(yǎng)基并進行BS-Z15 發(fā)酵，對比不同氮源對BS-Z15 生長及產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的影響，篩選最優(yōu)氮源；分別以5.0g/L 的FeSO4、ZnSO4、CaCl2、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O 替換牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的NaCl，其余成分不變，制備培養(yǎng)基并進行BS-Z15發(fā)酵，對比不同無機鹽對BS-Z15生長及產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的影響，篩選最優(yōu)無機鹽。

1.2.3 最適碳源、氮源及無機鹽不同濃度的響應(yīng)面實驗

對于篩選獲得的最優(yōu)碳源、氮源、無機鹽，分別取三個濃度（表1），使用響應(yīng)面設(shè)計軟件Design-Expert 8.0.6設(shè)計實驗組，并檢測各實驗組對BS-Z15生長（OD600nm處吸光值）及產(chǎn)抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響。統(tǒng)計建模，預(yù)測最優(yōu)培養(yǎng)基，并通過發(fā)酵實驗進行驗證。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.2.4 活性產(chǎn)物產(chǎn)量檢測驗證方法

以0-60%連續(xù)濃度梯度乙腈溶液作為洗脫劑，以O(shè)D220nm為分離組分指示，采用HPLC法分離正丁醇提取物的各組分，用雙層板抑菌實驗檢測各組分對大麗輪枝菌的抑制活性，確定抑菌產(chǎn)物色譜峰，并以其峰面積為抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)量指標(biāo)，分析優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對枯草芽孢桿菌BS-Z15菌體生長及抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

如圖1 所示，各種碳源中蔗糖、山梨醇顯著益于BS-Z15 菌體生長（P＜0.05）；葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇單糖均益于BS-Z15其菌體生長量和抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)積累（P＜0.05），其中葡萄糖對抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)產(chǎn)量影響最佳；玉米粉、淀粉等多糖顯著劣于單糖和對照（P＜0.05）。所以，以菌體生長為目標(biāo)可選取蔗糖和山梨醇為碳源，以產(chǎn)抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)為目標(biāo)，可以選取葡萄糖為碳源，同時以菌體生長及產(chǎn)抗大麗輪枝菌物質(zhì)為目標(biāo)，可選用葡萄糖作為優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源。

圖1 不同碳源對BS-Z15生長及產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)量的影響（P＜0.05）

2.2 不同氮源對枯草芽孢桿菌BS-Z15菌體生長及抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

如圖2 所示，不同氮源對BS-Z15 生長及產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)影響極為顯著，其中有機氮源顯著優(yōu)于無機氮源（P＜0.05），且在無機氮源培養(yǎng)基中，BS-Z15發(fā)酵幾乎不能合成抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)。有機氮源酵母浸粉較蛋白胨能顯著提高BS-Z15菌體生長速度和抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)產(chǎn)量（P＜0.05）。

圖2 不同氮源對枯草芽孢桿菌BS-Z15發(fā)酵及產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響（P＜0.05）

2.3 無機鹽對枯草芽孢桿菌BS-Z15菌體生長及抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

對比了FeSO4、ZnSO4、CaCl2、MnSO4·H2O、KNO3、MgSO4·2H2O 各種無機鹽對BS-Z15 發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，BS-Z15 在這些無機鹽培養(yǎng)基中均能生長，但在ZnSO4、CaCl2、KNO3作無機鹽的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌BS-Z15 的生長都顯著低于對照組及其他無機鹽（P＜0.05）；在CaCl2·2H2O、ZnSO4作無機鹽的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌BS-Z15 不能產(chǎn)抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)。在添加FeSO4、MnSO4·H2O 和MgSO4·2H2O 無機鹽培養(yǎng)基中，顯著促進BS-Z15 抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量（P＜0.05）。綜合分析，可能是陽離子為主要影響因素，其中Mg2+、Mn2+和Fe2+能促進BS-Z15 產(chǎn)抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)，尤其Mn2+和Fe2+作用更為顯著，但三者對BS-Z15的菌體生長無顯著作用；Ca2+對BS-Z15的生長及產(chǎn)生活性物質(zhì)具有抑制作用。故Mn2+和Fe2+可作為優(yōu)化培養(yǎng)基的無機鹽離子。

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化枯草芽孢桿菌BS-Z15發(fā)酵培養(yǎng)基

根據(jù)上述實驗結(jié)果，選擇以葡萄糖（A）、酵母浸粉（B）和MnSO4·H2O（C）為優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源、氮源和無機鹽，并對這3 個因素各自設(shè)計3 個濃度水平，采用響應(yīng)面實驗設(shè)計軟件設(shè)計實驗組，并檢測各實驗組對BS-Z15 發(fā)酵產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的影響，結(jié)果如表2 所示。對表2 結(jié)果進行Box-Behnken 分析，結(jié)果如表3所示，該模型失擬項P=0.1865＞0.05，R2=0.9732，相關(guān)度好。通過模型分析表明葡萄糖對BS-Z15產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的影響最為顯著，其次為酵母浸粉，再次為無機鹽。

圖3 不同無機鹽對枯草芽孢桿菌BS-Z15發(fā)酵及產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響（P＜0.05）

表2 不同因素及水平實驗設(shè)計的結(jié)果

表3 Box-Behnken分析各因素對BS-Z15抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

注：*，P＜0.05，顯著；**，P＜0.01，極顯著。

構(gòu)建響應(yīng)值對試驗因子的三維空間曲面圖，分析3種因素間的兩兩交互作用（圖4），結(jié)果表明碳源（葡萄糖）和氮源（酵母浸粉）響應(yīng)面圖形陡峭，交互作用最強，碳源（葡萄糖）和無機鹽（硫酸錳）響應(yīng)面圖形平穩(wěn)，交互作用相對較弱。

圖4 響應(yīng)面法分析各因素對BS-Z15活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響（P<0.05）

對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，可得到抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)Y 的產(chǎn)量（抑菌圈直徑大小）和各因子（A，B，C）之間的回歸方程如下：

根據(jù)模型預(yù)測得出，當(dāng)葡萄糖濃度為11.61g/L，酵母浸粉濃度為11.22 g/L，無機鹽濃度為0.99 g/L，抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)產(chǎn)量到達最大值，抑菌圈理論直徑為28.215 mm.對發(fā)酵培養(yǎng)基預(yù)測值進行驗證試驗，取平均值測得BS-Z15 抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)抑菌圈直徑為29.1 mm.預(yù)測值與實測結(jié)果一致，表明回歸方程能夠比較真實地反映各因素對抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響。

2.5 活性物質(zhì)主效成分鑒定及峰面積對比

使用HPLC 法對粗提物進行定量分析，得到四個顯著吸收峰（圖5A峰譜圖中P1、P2、P3、P4四峰物質(zhì)，其中P1 為溶劑DMSO），經(jīng)抑菌實驗鑒定，P2、P3 物質(zhì)對大麗輪枝菌無抑菌活性，P4 物質(zhì)具有強抑菌活性（圖5B），故認(rèn)定粗提物主效成分為P4物質(zhì)。通過對等量發(fā)酵液分離純化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及優(yōu)化培養(yǎng)基P4物質(zhì)抑菌圈大小比對（圖5B中P4與P4'），確定優(yōu)化培養(yǎng)基活性物質(zhì)產(chǎn)量更多。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基與最適培養(yǎng)基獲得的活性物質(zhì)粗提物使用液相色譜儀進行分析，結(jié)果如圖5。經(jīng)儀器讀數(shù)分析，基礎(chǔ)培養(yǎng)基活性物質(zhì)P4 物質(zhì)峰平均面積為14167.87 mAU*min，優(yōu)化培養(yǎng)基P4物質(zhì)平均峰面積為25131.50 mAU*min，優(yōu)化后主效物質(zhì)量提升77.38%，且優(yōu)化培養(yǎng)基中BS-Z15的生長量顯著高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基（P＜0.05，圖5C），達到優(yōu)化目標(biāo)。

圖5 BS-Z15抗真菌物質(zhì)主效成分的分離鑒定

3 討論

研究表明，枯草芽孢桿菌屬因其能夠產(chǎn)生多種有效抑制病原微生物的次生代謝產(chǎn)物，正在成為研究的熱點。越來越多的研究表明，枯草芽孢桿菌對營養(yǎng)的要求低，但不同亞種對營養(yǎng)的利用率也不同，因此在進行發(fā)酵條件探究實驗時，需要對單一菌種進行具體研究，探尋適合其發(fā)酵及產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)源種類。

枯草芽孢桿菌BS-Z15 在使用多種營養(yǎng)源替換的培養(yǎng)基后，在各培養(yǎng)基中均能良好生長并能產(chǎn)生抗大麗輪枝菌的活性物質(zhì)，說明BS-Z15菌體生長及產(chǎn)抗大麗輪枝菌物質(zhì)對營養(yǎng)要求低，可以高效穩(wěn)定產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)，是一株有巨大生防潛力的菌種。

本研究證明，BS-Z15發(fā)酵培養(yǎng)，單糖優(yōu)于二糖，二糖優(yōu)于多糖。本研究僅僅采用了單種糖作為碳源進行研究，是否可以通過單糖與二糖、單糖與多糖混合來滿足BS-Z15 發(fā)酵，需要進一步研究。因單糖純化成本較高，如果采用混合糖能滿足要求，將可以在提高發(fā)酵效率的基礎(chǔ)上降低成本。

無機鹽為MgSO4、MnSO4及FeSO4時能顯著提高枯草芽孢桿菌BS-Z15產(chǎn)生抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)，Mg2+、Mn2+及Fe2+可能是抗真菌活性物質(zhì)合成的酶合成所需因子；而添加Ca2+、Zn2+抑制BS-Z15 產(chǎn)生抗大麗輪枝菌活性物質(zhì)，可能這幾種離子抑制了活性物質(zhì)合成的某種酶活性。而在對照培養(yǎng)基中沒有添加Mg2+、Mn2+及Fe2+也能發(fā)酵獲得真菌活性物質(zhì)，推測是因為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中含有少量的這些必需的輔助因子。這一實驗結(jié)果為進一步深入研究BS-Z15合成抗真菌活性物質(zhì)的生物途徑提供了思路。

在氮源篩選中，有機氮源種類較少，而獲得的最優(yōu)氮源蛋白胨為復(fù)雜的混合成分，且成本較高，在后續(xù)的研究中，可以選擇其他氮源進行比較。

文章通過響應(yīng)面法設(shè)計和篩選，獲得了葡萄糖11.61g/L、酵母浸粉11.22 g/L、MnSO4·H2O 0.99 g/L 優(yōu)化培養(yǎng)基，經(jīng)過HPLC 法分析證實了優(yōu)化后抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量提升77.38%，為高效發(fā)酵枯草芽孢桿菌BSZ15生產(chǎn)抗真菌物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。