趙素芬 王運盛 李婧倫 蔣 鵬 滑 榮 張 歡 胡 昕 詹同彤 李 茹* 盧 巖*
(1.北京動物園管理處,圈養(yǎng)野生動物技術(shù)北京市重點實驗室,北京,100044;2.大連森林動物園有限公司,大連,116013)
丹頂鶴(Grusjaponensis)為鶴科(Gruidae)鶴屬的大型涉禽,我國一級重點保護野生動物[1],IUCN易危(VU)物種(https://www.iucnredlist.org/search?query=Grus%20japonensis&searchType=species),CITES附錄Ⅰ物種。截至2019年12月,我國28個省級行政區(qū)的90個圈養(yǎng)單位飼有丹頂鶴,圈養(yǎng)種群數(shù)量總計2 386只[2],丹頂鶴飼養(yǎng)保護工作取得了長足的發(fā)展。然而近些年,我國多地動物園及自然保護區(qū)出現(xiàn)丹頂鶴及其他珍稀鶴類突然發(fā)病死亡,瀕死前進行血液學檢查,發(fā)現(xiàn)血液內(nèi)寄生大量原蟲,對病原進行形態(tài)學鑒定,疑似為瘧原蟲科(Plasmodiidae)的住白細胞原蟲(Leucocytozoonsp.)。2020年,大連某動物園1只119日齡丹頂鶴幼鶴發(fā)病,治療1 d后死亡,經(jīng)尸體剖檢、實驗室檢查和病理學檢查,分析該病例死于血液原蟲感染,現(xiàn)將病例報告如下。
患病丹頂鶴為人工育雛鶴,30日齡后與同年繁育幼鶴合籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)籠舍與成年鶴籠舍相鄰。該丹頂鶴發(fā)病前1 d采食量減少,發(fā)病當日精神沉郁、排綠色水樣便,采集糞便樣品,使用直接鏡檢法進行便常規(guī)檢查,肌內(nèi)注射頭孢曲松鈉和阿米卡星。治療無效,次日死亡。
1.2.1 剖檢及病理組織學檢查
剖檢發(fā)病死亡的丹頂鶴,觀察其病理變化。采集心、肝、脾、肺、腎和腸等組織,迅速投入10%的福爾馬林液,進行病理石蠟切片前處理;同時,使用無菌鋒利刀片剖開肝臟,清潔載玻片輕觸新鮮剖面,制備肝組織印片,自然風干,用甲醇固定。
1.2.2 瑞氏吉姆薩染色
使用瑞氏吉姆薩染液染色肝組織印片15 min;雙蒸水漂浮,流水沖洗,風干,在光學顯微鏡下觀察。
1.2.3 HE染色
石蠟切片分別經(jīng)二甲苯脫蠟,100%、95%、85%、75%、50%乙醇梯度復(fù)水,下行至雙蒸水中,蘇木精染色15 min,1%鹽酸乙醇分色數(shù)秒,水洗返藍15 min;再依次通過50%、75%、85%、95%乙醇梯度脫水后,伊紅染色1 min,95%乙醇洗滌,再經(jīng)無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察組織病理學變化情況。
1.2.4 細菌分離培養(yǎng)
采集死亡丹頂鶴心、肝、腎和脾,無菌條件下使用直接劃線法接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。
死亡丹頂鶴尸僵完全,機體消瘦(圖1A)。心外膜表面散在大量出血點,心耳水腫(圖1B);肝腫大,表面散在分布大量的、界限清晰的、圓形的、大小不一的出血點及灰白色小結(jié)節(jié)(圖1C);脾腫大,表面有點狀出血(圖1D);腎腫大、質(zhì)脆(圖1E);小腸腫脹,切面外翻,黏膜面有散在出血點(圖1F);直腸輕度水腫,出血。其余臟器眼觀未見異常。
圖1 丹頂鶴臨床剖檢結(jié)果
瑞氏吉姆薩染液染色,肝組織印片內(nèi)可觀察到大量寄生于細胞內(nèi)的、藍染的、直徑6~14 μm、不同發(fā)育狀態(tài)的、圓形或橢圓形的蟲體,游離于細胞的蟲體多呈棒狀或香蕉狀(圖2)。
圖2 丹頂鶴肝組織印片
心:低倍鏡下觀察,可見心肌大面積壞死、心肌萎縮,炎性細胞浸潤,心肌水腫,肌纖維間隙增寬;高倍鏡下觀察,肌纖維間隙及血管內(nèi)散在大量寄生于細胞內(nèi)的、藍染的、直徑6~14 μm、呈圓形、橢圓形或香蕉狀的蟲體(圖3A)。
肺:低倍鏡下觀察,肺組織出血、淤血,肺內(nèi)出現(xiàn)大面積藍染壞死區(qū)域;高倍鏡下觀察,肺泡壁毛細血管擴張、淤血,血管腔內(nèi)可見大量纖維素及紅細胞,肺泡壁及血管腔內(nèi)可見大量藍染蟲體寄生,壞死區(qū)域邊緣寄生大量蟲體(圖3B)。
腎:低倍鏡下觀察,腎組織大面積水腫,腎小管失去固有結(jié)構(gòu);高倍鏡下觀察,腎小管上皮細胞變性、脫落和壞死,間質(zhì)可見大量蟲體寄生(圖3C)。
肝:低倍鏡下觀察,肝大面積壞死、藍染,肝淤血,中央靜脈內(nèi)蓄積大量血液,肝索紊亂,失去固有結(jié)構(gòu);高倍鏡下觀察,肝細胞崩解,細胞間隙及肝血竇內(nèi)可見大量藍染蟲體(圖3D)。
脾:低倍鏡下觀察,脾組織出現(xiàn)大面積壞死區(qū)域;高倍鏡下觀察,大量藍染蟲體寄生(圖3E)。
腸:腸絨毛固有層內(nèi)可見大量蟲體寄生(圖3F)。
圖3 丹頂鶴主要臟器病理學觀察結(jié)果
直接鏡檢法檢查丹頂鶴糞便樣品內(nèi)寄生蟲和潛血等,高倍鏡下觀察,未見白細胞和紅細胞,蛔蟲卵、滴蟲滋養(yǎng)體極少觀察到(表1)。
表1 丹頂鶴糞便常規(guī)檢測結(jié)果
采集死亡丹頂鶴心、肝、腎和脾,無菌條件下使用直接劃線法接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基,經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng),24、48 h后均無細菌生長。
根據(jù)肝組織印片、病理剖檢結(jié)論及實驗室檢驗結(jié)果,確認該丹頂鶴因血液原蟲感染致死。
本病例在發(fā)病時未采集血液進行血涂片檢查,但通過臨床癥狀、病理學檢查及臨床經(jīng)驗,該鶴與近些年我國多地動物園及自然保護區(qū)出現(xiàn)丹頂鶴及其他珍稀鶴類死亡病因相同,為血液原蟲感染致死。病原在體內(nèi)大量復(fù)制增殖,隨著病程發(fā)展,病原隨血液擴散至機體各個臟器,引起機體損傷,伴發(fā)寄生蟲性壞死,并繼發(fā)實質(zhì)性心肌炎,同時該病原寄生于紅細胞及白細胞內(nèi),引起動物貧血及免疫功能下降,甚至產(chǎn)生大量毒素,從而造成動物死亡。根據(jù)蟲體形態(tài)學結(jié)構(gòu),分析該致病原可能隸屬于頂復(fù)亞門(Apicomplexa),孢子蟲綱(Sporozoa),球蟲亞綱(Coccidia),血孢子蟲目(Haemosporidia)的住白細胞原蟲;基于鳥類血孢子蟲目常規(guī)引物進行套式PCR(第1輪擴增引物:HaemNF1,5′-CATATATTAAGAGAAITATGGAG-3′);HaemNR3,5′-ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC-3′。第2輪擴增引物:HaemF,5′-ATGGTGTTTTAGATACTTACATT-3′;HaemR2,5′-CATTATCTGGATGAGATAATGGIGC-3′),未能擴增出該病原的Cytb基因片段,其基因特點、分子生物學鑒定及分類有待進一步研究。
據(jù)報道,住白細胞原蟲的傳播媒介為雙翅目(Diptera)昆蟲蚋(Simuliidae)和蠓(Ceratopogouidae)等,蟲媒的活動習性使該病的發(fā)生呈明顯的季節(jié)性,多發(fā)于夏秋季,在雨季過后20 d左右開始發(fā)生,當氣溫高于20 ℃時,蠓的繁殖及活動最為活躍,該病的流行性明顯增加[3-4]。大連市2020年氣溫偏高,降水偏多,8月出現(xiàn)6次區(qū)域性暴雨、大暴雨和大風天氣,9月出現(xiàn)4次強對流天氣,降水量超同期。該鶴于2020年8月7日出殼,氣溫適宜蟲媒活動,合籠后飼養(yǎng)的籠舍環(huán)境易積水,利于蟲媒繁殖棲息,可能使該丹頂鶴在易感季節(jié)被叮咬感染。禽類對該病原的易感性與日齡成正比,危害程度隨年齡增加呈下降趨勢;幼禽感染后死亡率高,成年禽通常無明顯臨床癥狀,部分可耐過,死亡率較低[5]。該丹頂鶴病例為幼齡鶴,于119日齡開始出現(xiàn)癥狀,病程快,隔天即死亡,死亡時間正值秋冬換季時節(jié),推測為氣溫突變等外界因素造成機體抵抗力下降,誘發(fā)感染病原在體內(nèi)大量增殖,從而引起動物發(fā)病死亡。其他飼養(yǎng)單位亦有類似大連某動物園病例在秋冬季節(jié)發(fā)生死亡的情況。此外,幼鶴發(fā)病后排綠色水樣便,剖檢多臟器出血,肝表面可觀察到大量的灰白色病灶,這與禽霍亂癥狀相似,但臨床上極少報道丹頂鶴發(fā)生霍亂致死,住白細胞原蟲病導(dǎo)致幼鶴肝表面散布壞死灶,而非呈彌散性壞死,剖檢時需注意區(qū)分。
治療住白細胞原蟲感染的藥物通??蛇x擇磺胺二甲嘧啶、乙胺嘧啶和二氯二甲吡啶酚等[6-7]。賈婷[8]研究發(fā)現(xiàn),目前治療血液原蟲的藥物對鶴的治療效果欠佳,肌內(nèi)注射青蒿琥酯能夠在一段時間內(nèi)控制病情,但之后血液學檢查發(fā)現(xiàn),感染寄生蟲的血細胞數(shù)量會突然上升,隨即動物死亡,未來藥物治療研究仍是工作重點。目前,對于鶴類血液原蟲病仍以預(yù)防為主,在蟲媒活動頻繁的季節(jié)應(yīng)及時清理籠舍周邊的雜草、樹叢和積水,做好消毒工作,保持籠舍衛(wèi)生,減少吸血昆蟲孳生;亦可使用殺蟲劑如溴氰菊酯、戊酸氰醚酯和蠅毒磷等在籠舍周圍噴灑殺滅媒介昆蟲[9-10],有條件的籠舍建議安裝防蚊蟲紗網(wǎng),切斷傳播媒介[11]。在進入血液原蟲流行季節(jié)前,可在日糧中添加多種維生素以提高機體抵抗力。