耿廣耀 由玉巖 劉群秀

(1.上海動物園，上海，200335；2.北京動物園，圈養(yǎng)野生動物技術(shù)北京市重點實驗室，北京，100044)

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)又稱簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)，廣泛分布在真核、原核生物和病毒基因組中，是基因組中變化最快、多態(tài)性較高和兩端較為保守的一段序列[1]，具有易檢測、分型重復(fù)性好和統(tǒng)計方法多樣等優(yōu)點，可做為一種有效的遺傳標記，廣泛應(yīng)用于種群遺傳多樣性研究、物種保護、物種鑒定和親權(quán)分析等方面[2-5]。不同物種的微衛(wèi)星標記可在近緣物種中相互借用[6]，但不同物種有時會表現(xiàn)出特異性，進而出現(xiàn)引物通用性較差，不能確定擴增產(chǎn)物是否為期望序列，因此在應(yīng)用微衛(wèi)星進行遺傳多樣性研究時需要針對特定物種進行標記開發(fā)[7-8]。

豚鹿(Axisporcinus)隸屬鹿科(Cervidae)花鹿屬(Axis)，是國家一級重點保護野生動物，分布在南亞次大陸至東南亞的中南半島區(qū)域，我國境內(nèi)野生種群在20世紀60年代已滅絕，圈養(yǎng)種群僅分布在成都動物園、上海動物園和北京動物園。目前關(guān)于豚鹿分子標記開發(fā)的研究有限，余建秋等[9]利用磁珠富集法獲取7個微衛(wèi)星位點對成都動物園27只豚鹿個體進行親權(quán)分析；Wang等[10]利用RAD-seq對成都動物園圈養(yǎng)豚鹿進行遺傳多樣性研究。本研究基于Illumina MiSeq測序平臺對上海動物園圈養(yǎng)豚鹿進行微衛(wèi)星標記開發(fā)，篩選出7個SSR標記對該種群進行遺傳多樣性分析，探究這些標記在圈養(yǎng)豚鹿種群中的適用性，為豚鹿種群保護研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品及總DNA提取

1.2 SSR分子標記開發(fā)

將提取的DNA通過超聲隨機打斷，制備測序文庫。利用p(AG)10、p(AC)10、p(AAC)8、p(ACG)8、p(AAG)8、p(AGG)8、p(ACAT)6和p(ATCT)68種探針富集基因組文庫中的SSR片段。利用Illumina MiSeq平臺測序富集得到的SSR片段，并利用Primer 3 V2.3.6對Cluster內(nèi)簡單序列長度多態(tài)性(simple sequence length polymorphism，SSLP)大于2的SSR序列進行引物設(shè)計。

1.3 引物驗證與分型

選取80個SSR引物熒光標記后，對10個隨機樣品進行擴增和毛細管電泳檢測，篩選出擴增效率高和穩(wěn)定性好的多態(tài)性SSR引物。利用篩選出的SSR引物對22只豚鹿個體進行PCR擴增和毛細管電泳檢測。PCR反應(yīng)體系為20.0 μL：DNA模板1.0 μL(濃度為15 ng/μL)，Taq酶0.5 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，超純水14.0 μL，10×buffer 2.0 μL，dNTP 0.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10個循環(huán)；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Cervus 3.0和PopGene 3.2[11]分別計算各位點等位基因數(shù)(number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)、觀測雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(excepted heterozygosity，He)和哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，H-W)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 豚鹿基因組中SSR位點信息

利用微衛(wèi)星識別工具(MIcroSAtellite identification tool，MISA)采用搜索參數(shù)(mono-10、di-6、tri-5、Tetra-5、penta-5和hexa-5，復(fù)合序列中兩個不同SSR之間允許的最大間隔為100 bp)在7 639 467條序列(總長度2 571 197 198 bp)中，檢測到SSR片段序列5 684 557條，含1個以上SSR片段的序列為1 396 521條，以復(fù)合形式存在的SSR序列為2 412 186條。單堿基重復(fù)到六堿基重復(fù)在豚鹿基因組中均有分布，其中雙堿基重復(fù)占比最大，其次是單堿基重復(fù)，各堿基重復(fù)信息見表1。

表1 不同重復(fù)類型SSR統(tǒng)計

單堿基重復(fù)SSR位點以A/T重復(fù)為主，占比為96.27%。雙堿基重復(fù)中，AC/GT重復(fù)數(shù)為3 944 705，占比最大，為79.73%；AG/CT重復(fù)數(shù)為844 429，占比為17.07%；AT/AT重復(fù)數(shù)為156 843，占比為3.16%；CG/CG重復(fù)數(shù)為1 812，占比為0.04%。三堿基重復(fù)中主要重復(fù)為AAC/GTT、AAG/CTT和AGG/CCT。四堿基重復(fù)中主要重復(fù)為ACTC/GAGT。五堿基重復(fù)中主要重復(fù)為AACAC/GTGTT。六堿基重復(fù)中主要重復(fù)為ACACCC/GGGTGT。

2.2 多態(tài)性SSR引物篩選與遺傳多樣性分析

試驗篩選出7個擴增效率高和穩(wěn)定性好的多態(tài)性SSR引物，引物序列信息見表2。7個SSR標記在22只圈養(yǎng)豚鹿個體中共檢測到19個等位基因，單個標記的等位基因數(shù)為2～5個，平均值為2.714個，觀測雜合度為0.227～1.000，平均值為0.680，期望雜合度為0.206～0.672，平均值為0.513。多態(tài)性信息含量為0.181～0.590，平均值為0.421。哈迪-溫伯格平衡檢驗經(jīng)Bonferroni校正后，有2個位點不符合哈迪-溫伯格平衡(表3)。

表2 引物序列信息

表3 豚鹿7個多態(tài)性基因位點分析

3 討論

通過近緣物種間引物借鑒、公共數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻[12]查找，小片段DNA克隆法和傳統(tǒng)微衛(wèi)星富集文庫法得到的微衛(wèi)星標記可以在一定程度上滿足遺傳多樣性研究、遺傳結(jié)構(gòu)分析和親緣關(guān)系鑒定等工作[9，13]，但因工作量大、成本高無法滿足連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位和QTL分析等需要大量標記的研究。利用通量大和周期性短的高通量測序技術(shù)，將通過探針富集得到的SSR序列測序獲取微衛(wèi)星位點，是目前大量獲取微衛(wèi)星序列的一種常用方法，該技術(shù)也是目前從gDNA、cDNA和EST中篩選微衛(wèi)星位點的一種方式。本研究利用高通量測序技術(shù)對探針富集所得序列測序，得到的SSR標記對豚鹿物種構(gòu)建遺傳連鎖圖譜和分子標記的開發(fā)等具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)豚鹿SSR位點以雙堿基重復(fù)為主，其次是單堿基重復(fù)，與梅花鹿(Cervusnippon)[14]和大鼠[15]等物種的微衛(wèi)星優(yōu)勢重復(fù)類型一致，與牛、綿羊[16]和豬[17]等以單堿基重復(fù)為主的類型不同，這可能是由豚鹿自身基因決定的，也可能與本研究采取的SSR開發(fā)方法有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，選用不同的搜索參數(shù)會出現(xiàn)不同優(yōu)勢的堿基重復(fù)類型[18-19]，也可能是此種原因?qū)е铝穗嗦筍SR分子標記以雙堿基重復(fù)為主，但大部分研究認為雙堿基重復(fù)是物種優(yōu)勢重復(fù)堿基類型[20]，本研究也證明了此種觀點。其他類型的堿基重復(fù)所占比例總體上呈現(xiàn)隨重復(fù)單位的增加所占比例減少的趨勢，符合有關(guān)研究規(guī)律[21]。在單堿基重復(fù)中，以A/T重復(fù)為主，是物種中普遍存在的現(xiàn)象。在雙堿基重復(fù)中，AC/GT重復(fù)占比遠大于另外3種重復(fù)，這與動植物中SSR DNA中AC/GT含量豐富的研究結(jié)果[22-24]相一致，此種現(xiàn)象可能是由于在DNA復(fù)制過程中，連接A、T的雙鍵比連接G、C的三鍵更容易斷裂導(dǎo)致。

群體雜合度的高低可以反映群體在多個基因座上的遺傳變異程度。本研究所選種群的平均觀測雜合度為0.680，平均期望雜合度為0.513，表明該群體的遺傳多樣性較高，觀測雜合度與期望雜合度有差異說明該種群存在雜合子缺失或存在純合子過剩的現(xiàn)象。本研究中有2個位點不符合哈迪-溫伯格平衡，這可能與近親雜交、存在無效等位基因、種群退化和圈養(yǎng)管理模式等因素有關(guān)。多態(tài)性信息含量(PIC)是衡量群體遺傳多樣性的一個重要參數(shù)，依據(jù)其值高低分為高度多態(tài)位點(PIC>0.50)、中度多態(tài)位點(0.25≤PIC≤0.50)和低度多態(tài)位點(PIC<0.25)。本研究篩選出的7個SSR標記，高度多態(tài)位點有3個，中度多態(tài)位點有3個，低度多態(tài)位點有1個，這可能是因樣本量小于25所致[25]。

本研究采用Illumina MiSeq測序平臺結(jié)合SSR富集文庫測序方法開發(fā)的豚鹿SSR分子標記，能夠為豚鹿種群的遺傳多樣性和連鎖圖譜構(gòu)建等研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。