江煜靈，湯志成，袁 紅，黃木清

（1. 東莞市公安局，廣東 東莞 523000；2. 廣州高盛智造科技有限公司, 廣州 510664）

刑事案件現(xiàn)場(chǎng)遺留的生物物證日趨微量，且常混有泥灰、油污等雜質(zhì)（抑制物），從而使相關(guān)DNA提取的難度加大，故成功提取檢材的DNA模板就成為檢驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前有多種微量DNA的提取方法，最常用的包括Chelex-100法、磁珠法、硅珠法、硅膜法、直擴(kuò)法等。這些方法在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)檢材具有一定的針對(duì)性，不同種類的檢材采用不同的方法其提取效果是不同的，且不同方法的自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)程度也差異較大。

磁珠法作為目前主流的DNA提取方法，由于其提取靈敏度較高，對(duì)抑制物的去除能力較強(qiáng)且易于自動(dòng)化，故得到了廣泛的應(yīng)用[1-2]。硅珠法在脫落細(xì)胞等微量生物檢材以及骨骼、牙齒等疑難生物檢材提取中的成功應(yīng)用亦為很多學(xué)者所肯定[3-4]。但由于硅珠不易富集，需人工離心操作才能避免洗滌過(guò)程所導(dǎo)致的較大DNA損失，故使得硅珠法的自動(dòng)化研發(fā)較慢[5]。X-Pure 96 Plus工作站內(nèi)置有離心機(jī)，集成了硅珠法和磁棒式磁珠法兩種提取方法，對(duì)檢材的適應(yīng)性因而得以增強(qiáng)。本研究通過(guò)模擬樣本測(cè)試及案件檢材檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)該工作站在DNA提取質(zhì)量和效率上的應(yīng)用效能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

TraceMag微量DNA磁珠純化試劑盒（磁棒式）、TraceSili微量DNA硅珠純化試劑盒、X-Pure 96 Plus微量DNA自動(dòng)提取工作站（高盛智造，中國(guó)），Promega PowerPlex21試劑盒（Promega，美國(guó)），全自動(dòng)96道微量DNA提取工作站（博坤生物，中國(guó)），ABI-Veriti96 Well Fast Thermal Cycler擴(kuò)增儀、ABI-3500xl遺傳分析儀（Life Technologies，美國(guó)）。

1.2 材料

采集志愿者新鮮血液5 μL加入4 995 μL無(wú)菌純水配制成一份千倍稀釋血；吸取10 μL Promega PowerPlex21試劑盒中所帶的2 800M（濃度為10 ng/μL）樣品，加入990 μL無(wú)菌純水配制成一份濃度為0.1 ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液；測(cè)試雜質(zhì)包括：鐵銹（生銹鐵器上刮?。?、果汁（果粒橙飲料常溫放置兩天后備用）、藍(lán)色牛仔褲布條、油污（機(jī)動(dòng)車發(fā)動(dòng)機(jī)油）、白色墻灰、地上泥灰。

案件檢材細(xì)分為3類：1）手足接觸類：手印、腳印、汗斑以及作案工具上采集的擦拭物或粘取物等；2）口腔接觸類：瓶口拭子、吸管拭子、食物殘?jiān)?、口罩等?）隨身衣物類：衣褲、帽子、手套、皮帶、眼鏡等。

1.3 樣品提取、擴(kuò)增及電泳分析

樣品制備后，按照相關(guān)純化試劑盒各自說(shuō)明書(shū)經(jīng)工作站進(jìn)行提取，洗脫體積皆設(shè)定為50 μL；使用Promega PowerPlex21試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10 μL，體系配比為Primer∶Mix∶H2O∶DNA模板=2∶2∶1∶5，進(jìn)行29個(gè)循環(huán)擴(kuò)增；使用ABI-3500xl遺傳分析儀進(jìn)行電泳分析，上樣緩沖液體系為Hi-Di?甲酰胺∶內(nèi)標(biāo)（liz500）＝10∶1，每孔加入10 μL緩沖液+1 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)樣時(shí)間15 s，電泳電壓1.2 kV。

1.4 檢材的檢出及平均峰高

判定標(biāo)準(zhǔn)：1）內(nèi)標(biāo)峰標(biāo)定正確，Ladder每個(gè)基因座的等位基因峰在規(guī)定范圍內(nèi)，陽(yáng)性分型正確，陰性無(wú)基因峰，圖譜清晰；2）峰高大于或等于100 RFU，視為該基因座檢出；3）當(dāng)檢出基因座數(shù)達(dá)到13個(gè)或以上時(shí)，該檢材視為“檢出”DNA分型；4）結(jié)果為“檢出”的檢材占檢材總數(shù)的比例為檢材“檢出率”。視為“檢出”的檢材圖譜上包括Amelogenin在內(nèi)的所有檢出基因座的峰高平均值定義為該圖譜的平均峰高。

2 結(jié)果與討論

2.1 靈敏度測(cè)試

使用新鮮人血和標(biāo)準(zhǔn)DNA 2800M進(jìn)行靈敏度測(cè)試。設(shè)計(jì)樣本含量2800M：0.2、0.4、0.6、0.8 ng；千倍稀釋血：5、10、20 μL，每種含量配制6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)樣本，分別使用工作站的硅珠法和磁珠法兩種模式提取DNA，經(jīng)擴(kuò)增、電泳后得到的基因座檢出數(shù)和平均峰高如表1。

根據(jù)表1，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物2800M，應(yīng)用硅珠法和磁珠法得到的基因座檢出率差別不大，當(dāng)2800M含量達(dá)到0.6 ng時(shí)，兩種方法都能穩(wěn)定得到全部21個(gè)基因座分型，而在2800M含量較少時(shí)（0.2、0.4 ng），磁珠法的基因座檢出率比硅珠法稍高，磁珠法的平均峰高值也比硅珠法的平均峰高值大。這是因?yàn)榇胖榉ǖ恼麄€(gè)DNA提取過(guò)程是在一個(gè)管內(nèi)進(jìn)行，DNA吸附在磁珠表面上，通過(guò)磁場(chǎng)與液體分離，分離效率極高，DNA損失率低。

表1 使用硅珠法和磁珠法提取不同含量的2800M和千倍稀釋血的基因座檢出數(shù)和平均峰高Table 1 The number of loci detected and the average peak height obtained from different contents of 2800M and/or 1000-dilution blood extracted with either the silicon beads or the magnetic beads

而對(duì)于硅珠法，DNA吸附于硅珠表面，洗滌過(guò)程中DNA和洗滌液的分離需通過(guò)離心實(shí)現(xiàn)，分離效率取決于離心的效果，一些游離的硅珠因無(wú)法聚集沉淀而隨著洗滌液的去除造成DNA的損失[6]。因此整體而言，硅珠法的DNA損失率會(huì)比磁珠法稍高，在DNA含量較少的時(shí)候就會(huì)出現(xiàn)掉峰的情況，峰高也比較低。

對(duì)于千倍稀釋血，硅珠法的提取效率明顯比磁珠好，20 μL千倍稀釋血應(yīng)用硅珠法可以穩(wěn)定得到21個(gè)基因座分型，而應(yīng)用磁珠法只能得到平均16.7個(gè)基因座分型。原因或?yàn)椋阂环矫婀柚楸却胖榫哂懈〉牧?，在相同的體積內(nèi)，硅珠具有更大的表面積，硅珠表面的修飾會(huì)更加豐富[7-8]，對(duì)于不同長(zhǎng)度DNA片段的吸附會(huì)更加完整，而磁珠表面修飾后所能吸附DNA的范圍主要集中于中大片段，人血經(jīng)裂解后可能會(huì)發(fā)生片段斷裂，相對(duì)于磁珠法，硅珠法能提取到更加完整的血液DNA片段；另一方面，血液成分十分復(fù)雜，包括多種蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、酶等，下面2.2節(jié)的測(cè)試顯示硅珠法比磁珠法具有更好的雜質(zhì)去除能力，對(duì)于血液來(lái)說(shuō)，硅珠法能得到質(zhì)量更好的DNA模板。

2.2 純化能力測(cè)試

實(shí)際案件中的檢材種類繁雜，同類的檢材在不同的環(huán)境中所含有的雜質(zhì)種類及含量也不一致，本實(shí)驗(yàn)采用6種案件常見(jiàn)的雜質(zhì)進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)，雜質(zhì)使用量遠(yuǎn)大于實(shí)際案件檢材雜質(zhì)含量，測(cè)試該平臺(tái)在大劑量雜質(zhì)下的純化能力。6種雜質(zhì)及使用量見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)用0.8 ng 2800M和20 μL的千倍稀釋血作為基礎(chǔ)樣本，每組設(shè)置一個(gè)不添加雜質(zhì)的純凈樣本，其余樣本加入各種雜質(zhì)分別使用硅珠法及磁珠法進(jìn)行DNA提取，全部實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，得到的基因座平均檢出數(shù)如圖1、圖2。

表2 雜質(zhì)使用量Table 2 Impurities spiked and usage

由圖1可以看出，對(duì)于0.8 ng 2800M，硅珠法和磁珠法檢出率基本一致，除了油污和泥灰外，其余四種雜質(zhì)都能檢出20個(gè)以上的STR基因座（檢出率>95%），與純凈樣本的檢出率相差不大，說(shuō)明兩種方法的純化能力都很好，在含泥灰和油污的樣品中，STR基因座檢出數(shù)都大于16（檢出率>76%），也能達(dá)到同一認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)（13個(gè)STR基因座）。對(duì)于20 μL的千倍稀釋血（圖2），硅珠法對(duì)雜質(zhì)的去除能力比較好，效果由好到差為：鐵銹>牛仔褲>果汁>油污≈墻灰>泥灰，而磁珠法對(duì)雜質(zhì)的去除能力相對(duì)來(lái)說(shuō)稍差, 效果由好到差為：牛仔褲>果汁>鐵銹≈泥灰>墻灰>油污。

圖3和圖4是純凈樣本分別使用硅珠法和磁珠法提取得到的電泳圖譜，當(dāng)提取2800M（純凈標(biāo)準(zhǔn)DNA）時(shí)，兩種方法得到的圖譜均衡性都很好，當(dāng)提取對(duì)象為人血（成分復(fù)雜，含有各種蛋白、無(wú)機(jī)鹽及酶）時(shí)，兩種方法得到的譜圖均衡性也很理想，但硅珠法相對(duì)較優(yōu)，這說(shuō)明硅珠法去除雜質(zhì)的能力較好，能得到更純的DNA模板。

2.3 案件檢材檢出率

X-Pure 96 Plus微量DNA自動(dòng)提取工作站在本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際使用已近1年，案件接觸類檢材的提取主要用該工作站和全自動(dòng)96道微量DNA提取工作站（博坤生物）共同完成。經(jīng)統(tǒng)計(jì)近三個(gè)月接觸類DNA檢材的檢驗(yàn)情況得到各類檢材的檢出率，見(jiàn)表3。

表3 兩種方法提取三類接觸檢材的檢出率Table 3 Detection rate of two different methods with three kinds of contact samples from cases

在檢材數(shù)量較大的情況下，檢材檢出率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表3共統(tǒng)計(jì)了2 664份檢材的檢驗(yàn)情況，從手足接觸類及隨身衣物類檢材的檢驗(yàn)情況來(lái)看，兩臺(tái)工作站的磁珠法檢出率差異不大，手足接觸類檢材檢出率在35%~36%之間，隨身衣物類檢材檢出率在62%~64%之間，而硅珠法對(duì)這兩類檢材的檢出率明顯較高，分別達(dá)到40.51%和72.73%。而對(duì)于口腔接觸類檢材，兩臺(tái)工作站、兩種方法之間并無(wú)明顯差異。綜合來(lái)說(shuō)，X-Pure 96 Plus磁珠法（總檢出率42.49%）和全自動(dòng)96道微量DNA（博坤生物）磁珠法（總檢出率45.72%）檢驗(yàn)提取效果無(wú)明顯差異，均達(dá)到了較高的提取純化水平，而X-Pure 96 Plus硅珠法（總檢出率50.39%）的提取純化水平則表現(xiàn)得更為優(yōu)異。

3 結(jié)論

本文測(cè)試了X-Pure 96 Plus微量DNA自動(dòng)提取工作站兩種提取方法，即硅珠法和磁珠法的實(shí)驗(yàn)效果，顯示均達(dá)到了較高的純化水平。具體而言，磁珠法由于在分離過(guò)程中DNA損失率較硅珠法低，其提取超微量DNA檢材的靈敏度比硅珠法好，但硅珠法去雜質(zhì)的能力更好，DNA純度更高，所得到的圖譜均衡性也更好。在實(shí)際檢驗(yàn)中，對(duì)于狀況差、雜質(zhì)多或腐敗嚴(yán)重的檢材，可考慮優(yōu)先使用硅珠法提??；而狀況一般、雜質(zhì)不多的檢材，使用磁珠法則應(yīng)會(huì)有更好的靈敏度；對(duì)于微量血痕，硅珠法比磁珠法更有優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，X-Pure 96 Plus微量DNA自動(dòng)提取工作站具有較強(qiáng)的純化能力和提取效率，可根據(jù)檢材的類型選擇合適的提取方法，以最大限度提升DNA提取的質(zhì)量和效率。