韓詠梅

淄博市婦幼保健院，山東淄博 255000

出生缺陷是指嬰兒出生前發(fā)生的身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常，可由染色體畸變、基因突變等遺傳因素或環(huán)境因素引起，也可由這兩種因素相互作用或其他不明原因所致。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)是出生缺陷高發(fā)性國(guó)家，總發(fā)病率為5.6%，年均新增90萬(wàn)例，而染色體異常占比0.5%～0.8%，也是引起出生缺陷的高危因素。目前，超聲檢查、早中孕期血清學(xué)篩查是產(chǎn)前篩查的首選方式，但后者呈現(xiàn)檢出率低（70.00%）、假陽(yáng)性率高（5.00%）等缺陷，極易面臨漏診、誤診，增加不必要的介入產(chǎn)前診斷等行為。介入性產(chǎn)前診斷會(huì)增加自身負(fù)擔(dān)，面臨胎兒丟失（羊膜腔穿刺占比0.11%、臍靜脈穿刺占比0.35%）、宮內(nèi)感染和胎膜早破等狀況，造成產(chǎn)婦及家庭等層面負(fù)擔(dān)。探尋更為準(zhǔn)確、安全的產(chǎn)前篩查方式，盡早評(píng)估胎兒染色體是否異常，是增強(qiáng)產(chǎn)前診斷效率、質(zhì)量的關(guān)鍵[1]。選取2020 年1 月—2021 年6 月淄博市婦幼保健院施行無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)孕婦共21 705 例為研究對(duì)象，明確胎兒游離DNA 高通量測(cè)序的價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院施行無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)孕婦共21 705 例為研究對(duì)象，平均年齡（31.62±5.03）歲、平均孕周（18.73±3.15）周。

1.2 方法

①采血。抽取10 mL 外周血置入Cell-Free DNA BCT 采血管（血漿游離DNA 采血管）內(nèi)，上下顛倒8～10 次，保證其均勻混合，再?gòu)堎N條碼做好標(biāo)記；置于4～8℃環(huán)境下保存，48 h 內(nèi)送往遺傳專(zhuān)科實(shí)驗(yàn)室[2-3]。

②提取胎兒游離DNA。4℃環(huán)境下，將血樣經(jīng)16 00 g離心處理，10 min后取上層清液再次16 000 g離心處理10 min，以此清除白細(xì)胞及碎片，獲取上層血漿。依據(jù)磁珠法，提取游離DNA，再聯(lián)合定量分析儀的運(yùn)用鑒別其濃度[4-5]。

③建立DNA 測(cè)序庫(kù)。借助可逆末端終止測(cè)序法，建立相應(yīng)的DNA 測(cè)序庫(kù)，以cffDNA 為準(zhǔn)對(duì)其末端予以補(bǔ)平，再和測(cè)序通用引物連接；隨后構(gòu)建文庫(kù)施行產(chǎn)物純化處理，聯(lián)合Stepone plus QPCR 儀予以定量測(cè)定[6-7]。

④數(shù)據(jù)測(cè)序和分析。借運(yùn)用高通量基因測(cè)序儀，依據(jù)各流程標(biāo)準(zhǔn)施行測(cè)定，再將各數(shù)據(jù)傳遞至生物信息軟件，通過(guò)和基因組序列間的比較，獲取Z值（表明各染色體占比評(píng)分情況）。若Z值在-3.0～3.0為正常，＞3.0 表明為染色體三體，＜-3.0 表明為染色體單體高危[8-9]。

⑤介入性產(chǎn)前檢查、染色體核型。若胎兒cffDNA 檢測(cè)為高風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)在其知情同意下施行介入性產(chǎn)前檢查。是以B 超引導(dǎo)為前提，妊娠18～23+6周時(shí)采取羊膜腔穿刺，≥24 周時(shí)采用經(jīng)皮臍血穿刺，隨后施行細(xì)胞培養(yǎng)、染色等處理，獲取其核型[10]。

1.3 觀察指標(biāo)

分析檢測(cè)結(jié)果、檢測(cè)篩查效率及妊娠結(jié)局。

靈敏度=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）×100.00%；特異度=真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性）×100.00%；假陽(yáng)性率=假陽(yáng)性/（假陽(yáng)性+真陽(yáng)性）×100.00%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性（真陽(yáng)性+假陽(yáng)性）×100.00%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性/（真陰性+假陰性）×100.00%[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示；計(jì)數(shù)資料用[n(%)]表示。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果

21 705 例無(wú)創(chuàng)DNA 篩查中，檢出異常者279例，占比1.29%。包括61 例為T(mén)21 三體高風(fēng)險(xiǎn)、18 例為T(mén)18 三體高風(fēng)險(xiǎn)、23 例為T(mén)13 三體高風(fēng)險(xiǎn)、126 例性染色體非整數(shù)倍異常、49 例為其他常染色體異常、2例為多條染色體異常。見(jiàn)表1。

表1 外周血cffDNA檢測(cè)結(jié)果及染色體核型

針對(duì)T21、T18、T13 三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，取羊水穿刺法，施行染色體核型分析、FISH 聯(lián)合檢測(cè)；性染色體非整數(shù)倍異常、其他常染色體異常孕婦，取羊水穿刺法，施行染色體核型分析、基因芯片聯(lián)合檢測(cè)。

①T21 三體高風(fēng)險(xiǎn)者，羊水穿刺共55 例，包括：47,Xn,+21 核型34 例，46,Xn,r(21)(p13;q22.3)[88]/45,Xn,-21[12]核 型1 例，47,Xn,der(21)t(2;21)(p22.2;q21.3)+21 核型1 例，46,Xn 核型19 例。未羊水穿刺共6 例，包括1 例腦積水引產(chǎn)、1 例宮內(nèi)胎兒死亡引產(chǎn)，但均未采取后續(xù)研究。

②T18 三體高風(fēng)險(xiǎn)者，羊水穿刺共14 例，包括：47,Xn,+18 核型12 例，46,Xn 核型2 例。未羊水穿刺共4 例，包括1 例胎兒心臟異常引產(chǎn)，但未采取后續(xù)研究。

③T13 三體高風(fēng)險(xiǎn)者，羊水穿刺共17 例，包括：47,Xn,+13 核型1 例，核型正常16 例。余下6 例未采取產(chǎn)前診斷，但1 例應(yīng)多發(fā)畸形引產(chǎn)、1 例因唇腭裂引產(chǎn)。

④性染色體非整數(shù)倍異常（SCA）者，羊水穿刺共98例，包括：47,XYY核型8例，47,XXY核型15例，47,XXX 核型4 例，45,X 核型1 例，45,X/46,XX 嵌合核型3例，45,X/46,XY嵌合核型1例，45,X/47,XXX嵌合核型1 例，47,XXY/46,XY 嵌合核型1 例，46,X,?del(X)(p11.3p22.1)核型1 例。核型正常63 例，但基因芯片檢查中，檢出2 例致病性拷貝數(shù)變異，4 例臨床意義不明拷貝數(shù)變異。未采取產(chǎn)前診斷28 例，但1 例因唇腭裂引產(chǎn)、1例因胎膜早破引產(chǎn)。

⑤其他常染色體異常者，羊水穿刺共36 例，包括：46,XX,del(18)(p10)[52]/46,Xn,i(18)(q10)[8]核型1例，核型正常35 例，但基因芯片檢查中，檢出5 例致病性、可疑致病性拷貝數(shù)變異，7 例臨床意義不明拷貝數(shù)變異，8號(hào)染色體單親二倍體1例。未羊水穿刺共13 例，包括1 例宮內(nèi)死亡引產(chǎn)、1 例心臟異常引產(chǎn)。

⑥多條染色體異常者中，羊水穿刺共1 次，核型、基因芯片檢查均未存在異常；1 例孕婦確診為淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤后引產(chǎn)，但未采取后續(xù)研究。

2.2 檢測(cè)篩查效率

①T21 三體高風(fēng)險(xiǎn)，靈敏度為100.00%（36/36）、特異度為99.91（21 650/21 669）、假陽(yáng)性率為0.09%（19/21 669）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為59.01%（36/61）、陰性預(yù)測(cè)值為100.00%（21 650/21 650）。②T18 三體高風(fēng)險(xiǎn)，靈敏度為100.00%（12/12）、特異度為99.99%（21 691/21 693）、假陽(yáng)性率為0.01%（2/21 693）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為66.67%（12/18）、陰性預(yù)測(cè)值為100.00%（21 691/21 691）。③T13三體高風(fēng)險(xiǎn)，靈敏度為100.00%（1/1）、特異度為99.93%（21 688/21 704）、假陽(yáng)性率為0.07%（16/21 704）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為4.35%（1/23）、陰性預(yù)測(cè)值為100.00%（21 688/21 688）。④SCA，靈敏度為100.00%（35/35）、特異度為99.71%（21 607/21 670）、假陽(yáng)性率為0.29%（63/21 670）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為27.78%（35/126）、陰性預(yù)測(cè)值為100.00%（21 607/21 607）。⑤其他常染色體異常，靈敏度為100.00%（1/1）、特異度為99.84%（21 669/21 704）、假陽(yáng)性率為0.16%（35/21 704）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為2.04%（1/49）、陰性預(yù)測(cè)值為100.00%（21 669/21 669）。⑥多條染色體異常，特異度為100.00%（21 704/21 705）、假陽(yáng)性率為0.00%（0/2）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.00%（0/2）、陰性預(yù)測(cè)值為100.00%（21 704/21 704）。

2.3 妊娠結(jié)局

①外周血cffDNA 檢測(cè)異常者中，共隨訪276例，失訪3 例，隨訪率為98.92%。染色體異常者共83例，77 例已引產(chǎn)，余下6 例出生后表型未異常；核型正常者共144 例，因基因芯片異常引產(chǎn)9 例，電話隨訪135 例出生后無(wú)異常，58 例未施行介入性產(chǎn)前診斷，但6 例因彩超異常引產(chǎn)，2 例因胎死宮內(nèi)引產(chǎn)，1 例因胎膜早破引產(chǎn)，1 例因孕婦患淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤引產(chǎn)，余下45 例出生未見(jiàn)表型異常，失訪3 例。

②檢測(cè)結(jié)果未異常者21 426 例，電話隨訪妊娠結(jié)局共20 296 例，隨訪率為94.73%，其中1 425 例仍未分娩。包括流產(chǎn)21 例（0.11%）、胎兒發(fā)育停止28例（0.15%）、先天畸形47 例（0.25%）、出生后夭折18例（0.10%）。

3 討論

染色體異常作為胎兒出生缺陷的首要原因，由此產(chǎn)生的病癥均可稱(chēng)為染色體病，常表現(xiàn)為多發(fā)畸形、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及性發(fā)育障礙、重癥智力低下等，但目前仍沒(méi)有最佳治療方案，所以該類(lèi)患兒出生往往會(huì)增加家庭、社會(huì)等層面負(fù)擔(dān)[12]。在此期間，產(chǎn)前篩查和診斷等工作的施行，可盡早發(fā)現(xiàn)疾病，通過(guò)針對(duì)性干預(yù)，降低染色體病患兒出生。例如：孕婦外周血cffDNA 檢測(cè)技術(shù)，以自身安全可靠、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)成為產(chǎn)前篩查的首選，更是為遺傳咨詢(xún)提供助力，保證人口素質(zhì)健康[13-14]。

諸多研究證實(shí)，腫瘤患者血漿內(nèi)富含腫瘤細(xì)胞DNA，由此受到啟發(fā)。首次PCR 技術(shù)下測(cè)定孕婦外周血Y 染色體DNA 片段，從中獲取cffDNA，為產(chǎn)前篩查邁向新臺(tái)階。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，妊娠4 周時(shí)母體血漿可檢出cffDNA，妊娠8周以上時(shí)濃度呈穩(wěn)定狀態(tài)，并隨孕周的延長(zhǎng)而增加，妊娠12 周后93.5%胎兒游離DNA 含量達(dá)4%，可滿足高通量測(cè)序的檢測(cè)要求；分娩后胎兒游離DNA 快速下降，產(chǎn)后72 h 消失，即以孕婦外周血漿cffDNA 為前提的產(chǎn)前篩查，不會(huì)受到既往妊娠的影響，還可為疾病篩查提供可靠依據(jù)[15-16]。

目前，產(chǎn)前篩查是以T21、T18 及T13 常見(jiàn)染色體非整倍體異常為目標(biāo)染色體，且和血清學(xué)檢查相比呈現(xiàn)檢出率高、假陽(yáng)性率低等優(yōu)勢(shì)，是目前產(chǎn)前篩查的輔助項(xiàng)目。該研究可知，T21/T18/T13 復(fù)合靈敏度為100.00%，特異度分別為99.91%、99.99%、99.96%。和Zhou Q 等[17]學(xué)者研究結(jié)果相似，其研究結(jié)果T21、T18、T13 靈敏度均為100.00%，特異度分別為99.94%、99.90%、99.96%。

WHO 數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，人類(lèi)染色體異常中SCA 占據(jù)50%以上，且每400個(gè)表型正常群體中就會(huì)存在1例某種形式SCA，如47，XYY、47，XXX 及相關(guān)嵌合體，雖不表現(xiàn)為表型異常，但絕大部分胎兒會(huì)存在性功能發(fā)育障礙，少部分會(huì)表現(xiàn)為智力發(fā)育遲緩和性格改變。即使在胎兒正常出生后，經(jīng)家屬自述為表型正常，但也不能忽略有染色體異常傾向。另外，外周血cfffDNA 產(chǎn)前篩查存在個(gè)別假陽(yáng)性、假陰性事件，可能和限制性胎盤(pán)嵌合體、母體超重、母體染色體異常、母體患有惡性腫瘤等因素存在相關(guān)性[18]。該研究中有1 例高通量測(cè)序示胎兒多條染色體異常，孕婦確診為惡性腫瘤（淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤），考慮為孕婦游離凋亡細(xì)胞的腫瘤DNA 釋放到血液循環(huán)中，被誤認(rèn)為是胎兒的非整倍體。

綜上所述，孕婦外周血cffDNA 檢測(cè)是產(chǎn)前輔助篩查技術(shù)，呈現(xiàn)靈敏度和特異度高、假陽(yáng)性率低等優(yōu)勢(shì)，可彌補(bǔ)血清學(xué)篩查、B 超檢查等缺陷，其篩查結(jié)果更為精確，可避免漏診事件，還可減少不必要的介入性產(chǎn)前診斷，減輕胎兒死亡帶來(lái)的心理壓力，強(qiáng)化出生缺陷二級(jí)預(yù)防工作。