劉麗麗 李建輝 劉汝明 陳 駿 鄭雪良 楊海英 王登亮 孫建城

（1衢州市農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院果樹研究所，浙江衢州 324000；2衢州學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江衢州 324000；3衢州市柯城區(qū)林業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江衢州 324000）

薄殼山核桃（Carya illinoensis）為胡桃科（Juglandaceae）山核桃屬（Carya）特色堅(jiān)果和木本油料樹種，別名薄皮山核桃、碧根果、長(zhǎng)山核桃、美國(guó)山核桃，原產(chǎn)地為美國(guó)密西西比河流域[1-2]。薄殼山核桃種仁不飽和脂肪酸含量較高，具有降低膽固醇等保健作用[3]，同時(shí)還富含脂肪、蛋白質(zhì)、VE、氨基酸及多種微量元素，食味香醇可口，含油率最高可達(dá)80%。因此，薄殼山核桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，行業(yè)發(fā)展前景廣闊。

根際微生物作為土壤與植物相互作用的重要媒介，其生長(zhǎng)受到土壤和植物的雙重作用與影響。植物根系通過向根際釋放各種分泌物，吸引各類微生物在根際定殖，并影響其群落結(jié)構(gòu)與生態(tài)功能[4]，而根際微生物則通過調(diào)節(jié)有機(jī)質(zhì)的分解和提高土壤肥力在植物養(yǎng)分獲取中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5-6]。因此，根際土壤微生物受植物種類、環(huán)境條件、土壤理化性質(zhì)等多種因素的影響，不同植物種類對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著影響，而同類植物在不同生態(tài)環(huán)境中的根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也不同[7]。對(duì)于薄殼山核桃而言，了解其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征有助于揭示根系對(duì)根際環(huán)境的影響機(jī)制，但相關(guān)研究鮮見報(bào)道。

本文以浙江省衢州市引種的薄殼山核桃為研究對(duì)象，基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)薄殼山核桃根際與非根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，探討兩者之間的區(qū)別，揭示其根際效應(yīng)，以期為薄殼山核桃在衢州地區(qū)的引種推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

薄殼山核桃根際與非根際土壤樣品采集于衢州市農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院果樹研究所試驗(yàn)基地，引進(jìn)的品種為波尼。選擇建園3年、栽培管理措施相同、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的3株薄殼山核桃，每株在樹冠滴水線處隨機(jī)選取3個(gè)取樣點(diǎn)取樣并混合后用于分析。采用內(nèi)徑10 cm土鉆采集0～20 cm土層的樣品，收集直徑為1～5 mm的細(xì)根，用抖動(dòng)法過孔徑為1 mm土壤篩獲取根際土壤樣品。同時(shí)，在同一地塊中未種植薄殼山核桃植株的空地上，采用“Z”形方法隨機(jī)采集3份非根際土壤。將土壤樣品裝入已消毒的密封塑料袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取和測(cè)序

采用土壤微生物DNA提取試劑盒提取薄殼山核桃根際與非根際土壤樣品基因組總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并利用核酸定量分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。由杭州沃森生物公司通過Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。細(xì)菌擴(kuò)增引物為 B341F（5′-CCTACGGGNG GCWGCAG-3′）和B785R（5′-ACTACHVGGGTATCTAATCC-3′），真菌擴(kuò)增引物為 ITS-3（5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′）和 ITS-4（5′-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3′）。

表1 土壤微生物基因組DNA檢測(cè)結(jié)果

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，利用Duncan新復(fù)極差法（LSR）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。在97%相似水平上對(duì)可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）進(jìn)行分類分析，并在不同分類水平上統(tǒng)計(jì)種類組成。采用ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)計(jì)算微生物多樣性[8-9]。使用Blast在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ftp.ncbi.nih.gov/blast/db）進(jìn)行比對(duì)，將優(yōu)化序列根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列在門、綱、目、科、屬水平上進(jìn)行鑒定，比較分析其種類組成和豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄殼山核桃根際與非根際土壤微生物測(cè)序結(jié)果和數(shù)量分析

通過Illumina MiSeq高通量測(cè)序獲得了薄殼山核桃根際與非根際土壤細(xì)菌和真菌群落的優(yōu)化序列及其OTUs的信息。雙端序列（reads）拼接和過濾后，共得到薄殼山核桃根際與非根際土壤細(xì)菌序列數(shù)分別為23 786條和25 653條，非根際土壤細(xì)菌序列數(shù)比根際多1 867條；根際與非根際土壤真菌序列數(shù)分別為28 858條和40 021條，非根際土壤真菌序列數(shù)比根際多11 163條。

從表2和表3可以看出：細(xì)菌共獲得3 690個(gè)用于物種分類的OTUs，根際和非根際OTUs數(shù)量分別為 1 882個(gè)和 1 808個(gè)，兩者差異不顯著（P＞0.05）；真菌共獲得877個(gè)用于物種分類的OTUs，根際和非根際OTUs數(shù)量分別為305個(gè)和572個(gè)，兩者差異顯著（P＜0.05）。薄殼山核桃根際土壤中細(xì)菌的OTUs數(shù)量與非根際土壤相近，但真菌的OTUs數(shù)量顯著少于非根際土壤（P＜0.05），表明種植薄殼山核桃后，根際土壤中細(xì)菌的物種數(shù)量變化不大，但真菌的物種數(shù)量受到顯著影響。

表2 薄殼山核桃根際與非根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

表3 薄殼山核桃根際與非根際土壤真菌多樣性指數(shù)

2.2 薄殼山核桃根際與非根際土壤細(xì)菌多樣性

2.2.1 細(xì)菌種類組成。薄殼山核桃根際與非根際土壤中細(xì)菌相對(duì)豐度排名前3位的門分別為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria），其中放線菌門在根際與非根際土壤中的相對(duì)豐度均達(dá)到25%以上。在綱分類水平上，薄殼山核桃根際與非根際土壤中均以放線菌綱（Actinobacteria）的相對(duì)豐度最高，根際為22.92%，非根際為28.76%。從目分類水平來看，薄殼山核桃非根際土壤中以放線菌目（Actinomycetales）相對(duì)豐度最高，根際土壤中以其他目相對(duì)豐度最高。

2.2.2 細(xì)菌多樣性。從表2可以看出，根際和非根際土壤中細(xì)菌測(cè)序覆蓋率均達(dá)97%以上，表明兩者的測(cè)序結(jié)果都可以反映其真實(shí)情況。在生物多樣性指標(biāo)中，Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)的數(shù)值越大，被測(cè)樣品多樣性越高；Simpson指數(shù)值越小，生物多樣性越高。從表2可以看出，根際和非根際土壤樣品的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)值都比較大，表明兩者的細(xì)菌豐富度都比較高，但兩者之間的差異未達(dá)到顯著水平；根際與非根際土壤Simpson指數(shù)較為接近，根際土壤的Shannon指數(shù)略高于非根際，但兩者差異不顯著。由此可知，薄殼山核桃根際與非根際土壤中細(xì)菌豐富度總體較高，但兩者差異不顯著。

2.3 薄殼山核桃根際與非根際土壤真菌多樣性

2.3.1 真菌種類組成。薄殼山核桃根際與非根際土壤中真菌相對(duì)豐度均以子囊菌門（Ascomycota）最高，其中根際土壤中真菌相對(duì)豐度達(dá)82.97%，非根際土壤中真菌相對(duì)豐度達(dá)86.96%。在綱分類水平上，薄殼山核桃根際土壤中真菌以散囊菌綱（Eurotiomycetes）相對(duì)豐度最高，為 70.59%；非根際土壤中真菌以子囊菌門中未分類的綱相對(duì)豐度最高，為44.02%。從目分類水平來看，薄殼山核桃根際土壤中真菌以散囊菌目（Eurotiales）相對(duì)豐度最高，為68.95%；非根際土壤中真菌以子囊菌門中未分類的目相對(duì)豐度最高，為44.02%。

2.3.2 真菌多樣性。從表3可以看出，根際土壤和非根際土壤中真菌測(cè)序覆蓋率均達(dá)到99%以上，表明兩者的測(cè)序結(jié)果都可以反映其真實(shí)情況。從各項(xiàng)多樣性指數(shù)來看，Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)以及Shannon指數(shù)均為非根際土壤大于根際土壤，且差異顯著，表明非根際土壤中真菌多樣性顯著大于根際土壤（P＜0.05）；Simpson指數(shù)表現(xiàn)為非根際土壤顯著小于根際土壤（P＜0.05）。由此可見，薄殼山核桃根際與非根際土壤中真菌多樣性存在顯著差異，根際土壤真菌多樣性小于非根際土壤。

3 結(jié)論與討論

根際土壤微生物群落在植物生長(zhǎng)、發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)和病理等方面都扮演著重要角色[10]。本研究通過Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)薄殼山核桃根際與非根際土壤進(jìn)行了宏基因測(cè)序，獲得細(xì)菌和真菌序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃非根際土壤中細(xì)菌和真菌序列數(shù)分別比根際土壤多1 867條和11 163條，根際與非根際土壤中細(xì)菌的OTUs數(shù)量差異不顯著，非根際土壤中真菌的OTUs數(shù)量顯著大于根際土壤。從細(xì)菌和真菌組成來看，薄殼山核桃根際與非根際土壤中相對(duì)豐度最高的細(xì)菌為放線菌門、真菌為子囊菌門。從已有研究來看，放線菌能提高土壤抑病能力，子囊菌門的某些微生物能夠改善植物的抗菌、抗氧化作用，可以增加植物的生物量，提高植株的抗病性，促進(jìn)植株生長(zhǎng)[11]。由此可見，薄殼山核桃根際土壤中存在一些能抑制病原菌生長(zhǎng)的微生物，可增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境脅迫的耐受能力，這在其他研究中也有類似報(bào)道[12-13]。

從本研究采用的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)來看，薄殼山核桃非根際土壤中的真菌多樣性高于根際土壤，但細(xì)菌差異不顯著，這可能與薄殼山核桃根系分泌物有關(guān)。在植物生長(zhǎng)過程中，根系分泌物影響根際微生物的種類組成，是促進(jìn)植物根際形成不同微生態(tài)環(huán)境的重要因素[14]。黃玉茜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，花生（Arachis hypogaea）根系分泌物可以改變土壤中微生物群落的組成與多樣性。劉純等[16]研究發(fā)現(xiàn)，假高粱（Pseudosorghum zollingeri）根系分泌物對(duì)部分微生物有明顯的促進(jìn)作用，對(duì)部分微生物有顯著的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃根系分泌物對(duì)根際土壤中不同微生物的影響效應(yīng)各不相同，其對(duì)真菌具有顯著的抑制作用，但對(duì)細(xì)菌的作用并不明顯，表明其對(duì)根際土壤微生物的影響作用具有一定的選擇性。